液相芯片法驗(yàn)證蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)HIV-1結(jié)果的敏感性和特異性

李艷 潘彤 李浩龍 孔偉偉 袁玉華

作者單位：300308 天津，天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院空港醫(yī)院檢驗(yàn)科（李艷、袁玉華）

300052 天津，天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院檢驗(yàn)科（孔偉偉）

300110 天津，天津市血液中心（潘彤、李浩龍）

目前在臨床上血液篩查人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）最常用的方法為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。到目前為止，HIV-1的ELISA試劑已經(jīng)發(fā)展至第4代［1-4］。1983年美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)了第1個(gè)HIV抗體檢測(cè)試劑，即第1代HIV診斷試劑，用于獻(xiàn)血員的篩查，其原理為采用間接ELISA法，用純化裂解病毒的HIV抗原和部分純化的抗原檢測(cè)HIV免疫球蛋白G（IgG）抗體，這種病毒裂解物中不僅含有較多雜抗原，而且抗原的制備和純化都比較困難，假陽(yáng)性率和假陰性率均較高，窗口期較長(zhǎng)［5］?；蚬こ碳夹g(shù)的快速發(fā)展給HIV抗原的獲得提供了新的途徑，1990年5月HIV第2代診斷試劑面市，它通過(guò)間接ELISA法用基因工程重組或合成的HIV多肽抗原檢測(cè)HIV-1/2的IgG抗體，其制備安全、重復(fù)性好，與第1代試劑相比敏感度和特異度均有較大提高［6］。1994年，第3代試劑的反應(yīng)模式由前兩代的間接法改為雙抗原夾心法檢測(cè)標(biāo)本中的抗體，酶標(biāo)記物由特異性HIV抗原代替抗人IgG，可檢測(cè)HIV不同的抗體亞型HIV-1/2/O的IgG/M/A，敏感度和特異度均高于第1代和第2代試劑，改善了O群標(biāo)本的反應(yīng)性，窗口期縮短至22 d［5］，也是目前國(guó)內(nèi)外HIV檢測(cè)的主流方法。第4代試劑采用雙抗原或抗體夾心法，用重組或合成的HIV多肽抗原、P24單克隆抗體固相包被檢測(cè)HIV-1/2/O的IgG/M/A抗體、P24抗原，提高了血清陽(yáng)轉(zhuǎn)前標(biāo)本的檢出率［7］，且HIV-1早期篩查的效果優(yōu)于第3代試劑［8］。

ELISA法檢測(cè)HIV的敏感度較高，但檢測(cè)結(jié)果易出現(xiàn)假陽(yáng)性，HIV抗體假陽(yáng)性受檢者不僅要承受巨大的心理壓力，而且要承受不必要的治療，造成醫(yī)療資源浪費(fèi)。對(duì)采血機(jī)構(gòu)來(lái)說(shuō)，假陽(yáng)性結(jié)果還會(huì)造成大量血液的報(bào)廢和獻(xiàn)血員永久性丟失。

針對(duì)目前常規(guī)HIV-1的ELISA檢測(cè)試劑存在的上述問(wèn)題，我們采用液相芯片法，對(duì)蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)（Western Blot）確認(rèn)陽(yáng)性及陰性樣本進(jìn)行HIV-1 gp120、gp41、p24單片段抗原檢測(cè)抗體分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Luminex-200（美國(guó)Luminex公司）；電動(dòng)渦旋器VSM-3（美國(guó)PRO Scientific Inc.）；超聲儀KQ-700DV型（昆山市超聲儀器有限公司）；高速離心機(jī)（德國(guó)Heraus公司）；空氣浴振蕩器（HZQ-C哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；Milli-Q純水系統(tǒng)（日本Millipore公司）；Eppendorf微量加樣器（美國(guó)Eppendorf公司）。HIV-1 gp120、gp41、p24抗原（北京萬(wàn)泰公司）；Luminex微球（50#、56#、71#），抗體偶聯(lián)試劑盒（美國(guó)Luminex公司）；ELISA初檢試劑（HIV抗原抗體診斷試劑盒，北京萬(wàn)泰公司、北京金豪公司），復(fù)檢試劑（HIV抗原抗體診斷試劑盒，法國(guó)生物梅里埃、法國(guó)Bio-Rad）；生物素化二抗（美國(guó)BD公司）；SA-PE（美國(guó)Ivitrogen公司）；96孔板（美國(guó)康寧公司）；錫箔紙，普通生化試劑（天津聯(lián)星生物技術(shù)有限公司）。受檢標(biāo)本：均來(lái)自天津市血液中心。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 微球的包被 HIV-1的gp120、gp41、p24蛋白和微球的偶聯(lián)方法按照美國(guó)Luminex公司操作手冊(cè)進(jìn)行操作。

1.2.2 液相芯片法檢測(cè) 采用液相芯片法對(duì)經(jīng)ELISA法初檢和復(fù)檢為HIV-1陽(yáng)性而Western Blot檢測(cè)HIV-1確認(rèn)試驗(yàn)為陰性的樣本進(jìn)行檢測(cè)：① 加樣前用100 μL/孔的分析緩沖液潤(rùn)濕96孔板；② 加入陰性血清和用分析緩沖液稀釋25倍的陽(yáng)性血清（25 μL/孔）；③ 加入混勻稀釋好的微球（確保 100個(gè) /μL，25 μL/孔）；④ 室溫震蕩培養(yǎng)1 h；⑤ 室溫3 500 r/min離心5 min，棄去上清液；⑥ 125 μL/孔洗滌緩沖液洗滌微球，3 500 r/min離心5 min，棄去上清液；⑦ 重復(fù)第6步2次；⑧ 加入稀釋好的生物素化二抗（2 mg/L，25 μL/孔）；⑨ 室溫震蕩培養(yǎng)1 h；⑩ 室溫3 500 r/min離心5 min，棄去上清液；125 μL/孔緩沖液洗滌微球，3 500 r/min離心5 min，棄去上清液；每孔加入20 mg/L SA-PE 25 μL；室溫震蕩孵育30 min；室溫3 500 r/min離心5 min，棄去上清液；125 μL/孔洗滌緩沖液洗滌微球，3 500 r/min離心5 min，棄去上清液；加入125 μL/孔洗滌緩沖液重懸微球，采用Luminex-200檢測(cè)，Luminex-100軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究繪制受試者工作特征曲線 （receiver operating characteristic curve，ROC），評(píng)估ELISA法和液相芯片法對(duì)HIV-1抗體的檢測(cè)價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3種微球截?cái)嘀?用液相芯片法測(cè)定3種微球的cut-off值，即HIV陰性標(biāo)本的平均熒光強(qiáng)度（mean fluoresence intensity，MFI）+2× 標(biāo)準(zhǔn)差（SD），見表 1。

表1 76份HIV ELISA陰性標(biāo)本不同免疫微球的截?cái)嘀?/p>

2.2 HIV-1的 gp120、gp41、p24單片段抗原檢測(cè)不同樣本結(jié)果 應(yīng)用液相芯片法對(duì)Western Blot確認(rèn)HIV陽(yáng)性及陰性樣本進(jìn)行HIV-1 gp120、gp41、p24抗體的分析。結(jié)果顯示，根據(jù)《艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》判定標(biāo)準(zhǔn)，55份Western Blot檢測(cè)確認(rèn)HIV-1陽(yáng)性樣本，液相芯片法檢測(cè)全部為陽(yáng)性，符合率100%；76份ELISA初檢和復(fù)檢陰性標(biāo)本HIV-1 gp120、gp41、p24片段檢測(cè)均為陰性；86份ELISA檢測(cè)初檢和復(fù)檢為陽(yáng)性，而Western Blot檢測(cè)確認(rèn)陰性樣本，其HIV-1 gp120、gp41、p24單片段抗原檢測(cè)均陰性。見表2。

表2 液相芯片法檢測(cè)標(biāo)本HIV-1 gp120、gp41、p24單片段抗原結(jié)果

2.3 ROC曲線分析 液相芯片法檢測(cè)HIV-1抗體的敏感度（100%）和特異度（100%）均較ELISA法檢測(cè)HIV-1抗體好，兩種方法檢測(cè)HIV-1抗體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 兩種方法檢測(cè)HIV-1抗體的ROC曲線

3 討論

ELISA法檢測(cè)HIV抗體造成假陽(yáng)性的原因是多方面的，如試劑質(zhì)量（試劑材料的純度、檢測(cè)體系的優(yōu)化）、樣本（某些自身免疫性疾病造成的血漿蛋白出現(xiàn)異常）等，都會(huì)影響試劑的特異性。

被譽(yù)為“后基因組時(shí)代芯片技術(shù)”的液相芯片技術(shù)于20世紀(jì)90年代中期開始發(fā)展，又稱為懸浮芯片技術(shù)、多功能懸浮點(diǎn)陣技術(shù)、Luminex技術(shù)或xMAP技術(shù)。液相芯片技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)為僅需少量樣本即可同時(shí)定性、定量檢測(cè)同一樣本中的多種不同目的分子，即多重檢測(cè)。同時(shí)液相芯片技術(shù)具有很高的敏感度和特異度，載體微球表面積大，每個(gè)微球上可包被10萬(wàn)個(gè)捕獲抗體或抗原，如此高密度的捕獲抗體或抗原保證了能夠最大程度地與樣本中的抗原或抗體分子結(jié)合，提高了檢測(cè)的敏感度，最低檢測(cè)濃度可達(dá)到0.1 ng/L。每種微球檢測(cè)100個(gè)，將最終讀取熒光強(qiáng)度的中值作為結(jié)果，這相當(dāng)于對(duì)每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)100次，而ELISA法僅為雙復(fù)孔或三復(fù)孔，因此液相芯片法檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性是ELISA法無(wú)法比擬的。同時(shí)液相芯片法的敏感度也遠(yuǎn)高于任何現(xiàn)有的分析和診斷方法以及其他芯片法，已廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外科研和臨床檢測(cè)［9-10］。

采用液相芯片法對(duì)組成HIV-1 ELISA試劑的主要包被抗原HIV-1 gp120、gp41、p24單片段分別進(jìn)行檢測(cè)，Western Blot法確認(rèn)陽(yáng)性樣本檢測(cè)符合率為100%；對(duì)ELISA法初檢和復(fù)檢陰性標(biāo)本檢測(cè)符合率也為100%；對(duì)ELISA法檢測(cè)初檢和復(fù)檢陽(yáng)性、Western Blot檢測(cè)確認(rèn)陰性樣本的陰性符合率為100%。說(shuō)明液相芯片法檢測(cè)HIV-1的敏感度和特異度均明顯高于ELISA檢測(cè)試劑。

影響試劑敏感度和特異度的因素很復(fù)雜，除了HIV-1 gp120、gp41兩個(gè)片段，還有HIV-2 gp36（第3代試劑）和P24單克隆抗體（第4代試劑）組成的ELISA試劑，已有研究顯示HIV-1 ELISA試劑因多個(gè)抗原甚至抗體共同包被于微孔板，可能會(huì)造成免疫反應(yīng)的空間位阻，影響檢測(cè)的敏感度和特異度，而采用液相芯片法則可避免此效應(yīng)［11］，液相芯片法和Western Blot法聯(lián)合檢測(cè)可以提高HIV抗體檢測(cè)的敏感度［12］。設(shè)想采用液相芯片技術(shù)組成的HIV-1抗體檢測(cè)系統(tǒng)（如在本檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)用前加上HIV-2抗原片段）將成為新一代檢測(cè)試劑，發(fā)展前景良好。