丙型肝炎病毒核酸熒光定量檢測(cè)法的性能驗(yàn)證

崔燕紅 趙一琳 宛傳丹

作者單位：215500 江蘇常熟，常熟市醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是導(dǎo)致慢性肝炎的重要嗜肝病毒之一，全球感染人數(shù)很多。HCV長(zhǎng)期慢性感染會(huì)導(dǎo)致肝硬化和肝癌，因此慢性丙型肝炎（丙肝）已成為全世界重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題［1-2］。丙肝的診斷依賴實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，目前主要針對(duì)血清中的HCV抗原抗體進(jìn)行初篩。但進(jìn)行抗病毒治療時(shí)，血清HCV-RNA定量檢測(cè)才是實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)［3］。核酸定量檢測(cè)對(duì)試劑、樣本和操作的要求較高，因此有必要對(duì)實(shí)驗(yàn)室建立的檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行性能驗(yàn)證，以評(píng)價(jià)其為臨床提供可信報(bào)告的能力。ISO 15189質(zhì)量認(rèn)可規(guī)則明確指出，臨床實(shí)驗(yàn)室在開展某一檢測(cè)項(xiàng)目前需進(jìn)行方法學(xué)認(rèn)證，充分了解其檢測(cè)性能，評(píng)估并確認(rèn)分析性能是否符合預(yù)期用途［4］。本文擬對(duì)基于QIGEN cube全自動(dòng)核酸提取儀與ABI 7500核酸擴(kuò)增儀的HCV-RNA定量檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行多方面的性能驗(yàn)證，評(píng)價(jià)該方法在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 對(duì)美國(guó)ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀、QIGEN cube全自動(dòng)核酸提取儀、Eppendorf高速低溫離心機(jī)、杭州藍(lán)焰干式恒溫器和經(jīng)校驗(yàn)合格的Eppendorf連續(xù)可調(diào)式移液器進(jìn)行校準(zhǔn)。所用試劑盒及配套耗材為凱杰生物工程（深圳）有限公司的HCV核酸定量檢測(cè)試劑盒，確保有效期在規(guī)定范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境設(shè)施均滿足ISO 15189認(rèn)可準(zhǔn)則［5］有關(guān)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境設(shè)置的各項(xiàng)要求，包括溫度、濕度、生物安全、分區(qū)操作等。

1.2 標(biāo)本血清、試劑與耗材 HCV-RNA血清標(biāo)本為常熟市醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所接收的來(lái)自常熟本地綜合醫(yī)院送檢的丙肝患者標(biāo)本，所有標(biāo)本在分離血清后當(dāng)天貯存于-20 ℃的冰箱保存?zhèn)溆?。著重收集?qiáng)陽(yáng)性、臨界陽(yáng)性患者的血清，以同期經(jīng)篩查無(wú)肝炎病毒感染史，無(wú)嚴(yán)重肝功能損傷以及基礎(chǔ)疾病的檢查者血清作為陰性血清標(biāo)本。質(zhì)量控制（質(zhì)控）標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)自國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委臨床檢驗(yàn)中心，按說(shuō)明書要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)與保存。之后將收集的標(biāo)本轉(zhuǎn)入超低溫冰箱-80 ℃長(zhǎng)期保存（不超過(guò)2個(gè)月）。

1.3 核酸提取 利用QIA cube儀器進(jìn)行提取，操作步驟與試劑配制嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作程序（standard operating procedure，SOP）文件進(jìn)行，具體參考本實(shí)驗(yàn)室ISO 15189文件手冊(cè)中的QIA cube標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（文件編號(hào)：CSJYS-SOP-PCR-2012）。PCR 擴(kuò)增：50 ℃ 30 min，95 ℃ 15 min，95 ℃ 15 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 15 s，熒光采集點(diǎn) 50 ℃，45 個(gè)循環(huán)；反應(yīng)體系 50 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理 將HCV-RNA 檢測(cè)的初始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù)值（log值），輸入SPSS軟件，對(duì)相關(guān)的均值（）、標(biāo)準(zhǔn)差（s）、變異系數(shù)（CV）、回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r）等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 性能驗(yàn)證指標(biāo)

1.5.1 精密度 取2個(gè)濃度水平（level 1、level 2）的質(zhì)控血清15 mL，同一批次內(nèi)重復(fù)檢測(cè)3管，連續(xù)檢測(cè)5 d，每日1次。每個(gè)批次均繪制室內(nèi)質(zhì)控與標(biāo)準(zhǔn)品曲線。將每個(gè)樣本充分混勻，在相同環(huán)境下由同一名人員進(jìn)行操作。室內(nèi)質(zhì)控均在控，當(dāng)次試驗(yàn)數(shù)據(jù)可信有效。記錄檢測(cè)數(shù)據(jù)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件處理以評(píng)估批內(nèi)精密度和批間精密度。

1.5.2 正確度 取具有可溯源性的國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委臨床檢測(cè)中心丙肝核酸定量檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)（質(zhì)評(píng)）的血清樣本，共5個(gè)濃度水平。每個(gè)濃度水平重復(fù)檢測(cè)3次，同一批次完成，室內(nèi)質(zhì)控在控。記錄結(jié)果，計(jì)算與理論賦值（室間質(zhì)評(píng)實(shí)驗(yàn)室均值）的偏倚，最大允許偏倚＜7.5%。

1.5.3 線性范圍 采集臨床血清標(biāo)本，取高次方（1.0×108kU/L）陽(yáng)性混合血清5 mL。以陰性混合血清進(jìn)行10倍倍比稀釋，稀釋成8個(gè)梯度。每個(gè)梯度重復(fù)檢測(cè)3次。所有檢測(cè)實(shí)驗(yàn)在同一天同一個(gè)批次內(nèi)完成。室內(nèi)質(zhì)控在控，無(wú)離群值。將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填表，進(jìn)行線性相關(guān)分析評(píng)估該方法的線性區(qū)間。

1.5.4 檢測(cè)下限 取一份高值樣本（接近或高于線性上限10%～15%，N×108kU/L），用陰性混合血清10倍倍比稀釋成8個(gè)梯度，使最低梯度低于廠家聲明值（1.0×102kU/L），理論上達(dá)到10 kU/L。每個(gè)梯度的樣本重復(fù)測(cè)定3次，所有檢測(cè)實(shí)驗(yàn)均在同一天同一批次內(nèi)完成。室內(nèi)質(zhì)控在控，無(wú)離群值，檢驗(yàn)結(jié)果呈良好線性相關(guān)（同線性范圍驗(yàn)證）。再將最低梯度的樣本以陰性混合血清2倍稀釋，重復(fù)檢驗(yàn)20次，要求全部檢出，且與理論值絕對(duì)偏倚＜0.4 log值。

2 結(jié)果

2.1 精密度驗(yàn)證 將檢出的核酸拷貝數(shù)進(jìn)行對(duì)數(shù)化（log值）再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。濃度水平level 1和level 2的CV批內(nèi)和CV批間均小于廠家聲明的5%，同時(shí)也小于CNAS-CL36：2012文件［5］中7.5%的要求，見表1。說(shuō)明廠家聲明的重復(fù)精密度可靠，滿足ISO 15189醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的質(zhì)量要求［5］。5個(gè)批次質(zhì)控血清重復(fù)檢測(cè)的log值動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，見圖1。

表1 2個(gè)濃度水平質(zhì)控血清的精密度驗(yàn)證結(jié)果

圖1 level 1（上）和level 2（下）質(zhì)控品5 d內(nèi)5個(gè)批次精密度重復(fù)檢測(cè)log值的變化趨勢(shì)

2.2 線性范圍驗(yàn)證 經(jīng)回歸分析，得方程Y＝0.182+0.993X，相關(guān)系數(shù) R2＝0.999，相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)P＜0.01。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)在 1.6×102～1.9×108kU/L（拷貝數(shù)值）呈良好線性，較廠家聲明的線性范圍（1.0×102～5.0×107kU/L）有所擴(kuò)大。因此，可判斷廠家提供的線性范圍真實(shí)可信，符合文件標(biāo)準(zhǔn)要求［5-6］。HCV-RNA定量檢測(cè)的線性相關(guān)性見圖2，各稀釋梯度重復(fù)檢測(cè)3次的log值見表2。

2.3 正確度驗(yàn)證 本研究采用2016年度全國(guó)室間質(zhì)評(píng)HCV-RNA定量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。5份標(biāo)本共15個(gè)檢測(cè)結(jié)果，其中2份標(biāo)本結(jié)果為陰性（值為0）；3份標(biāo)本結(jié)果為陽(yáng)性，均值（log值）與檢驗(yàn)中心反饋的均值（理論值）偏倚均＜0.4 log值。驗(yàn)證結(jié)果均合格，正確度良好。見表3。

圖2 HCV-RNA定量檢測(cè)的線性相關(guān)性

表2 線性范圍驗(yàn)證結(jié)果

表3 5個(gè)濃度水平質(zhì)控血清的正確度驗(yàn)證結(jié)果

2.4 檢測(cè)下限驗(yàn)證 稀釋梯度的檢測(cè)方法同線性范圍，結(jié)果說(shuō)明當(dāng)理論值稀釋至101梯度時(shí)，檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)不穩(wěn)定性，但在102梯度檢測(cè)數(shù)據(jù)穩(wěn)定。將梯度102的樣本進(jìn)行2倍稀釋，重復(fù)20次檢測(cè)，結(jié)果檢出率為100%，且與理論值的偏倚均在0.4 log值內(nèi)。證明本方法的檢測(cè)下限為1.0×102kU/L，與廠家聲明值一致。見圖3。

圖3 檢測(cè)下限驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

RNA不穩(wěn)定且較易降解，對(duì)環(huán)境設(shè)備和實(shí)驗(yàn)操作人員的要求較高。實(shí)驗(yàn)室實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)HCV起步較晚，業(yè)界缺乏針對(duì)HCV檢測(cè)性能驗(yàn)證的報(bào)道［7-9］。本研究根據(jù)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和CNAS文件［5-6］，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況提出一套關(guān)于商品化試劑盒HCV核酸定量檢測(cè)的性能驗(yàn)證方案。所有實(shí)驗(yàn)操作要充分考慮樣本容器存在的瓶間差，在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，氣流氣壓均正常。宜取多瓶樣本復(fù)溶，充分顛倒混勻并靜置5 min，以保證樣本的勻質(zhì)性。再分裝在密閉小瓶中，-20 ℃以下保存。實(shí)驗(yàn)前半小時(shí)取出，于室溫融化，避免反復(fù)凍融。所有檢測(cè)實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控，若出現(xiàn)室內(nèi)質(zhì)控失控或其他操作問(wèn)題，應(yīng)將此批次數(shù)據(jù)棄去，另加一個(gè)批次實(shí)驗(yàn)。單次測(cè)量數(shù)據(jù)超出總均值±4 SD的為離群值；剔除數(shù)據(jù)量小于總測(cè)量數(shù)據(jù)量的5%［6］。

精密度是反映方法學(xué)性能的主要指標(biāo)，它確保了樣本在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的穩(wěn)定性、可靠性。精密度驗(yàn)證至少含有2個(gè)濃度水平，本研究采用HCV-RNA 2個(gè)濃度質(zhì)控血清（一個(gè)為N×103kU/L，另一個(gè)為N×106kU/L）的陽(yáng)性混合血清。質(zhì)控血清具有更好的勻質(zhì)性，排除了臨床樣本中可能存在的其他未明干擾因素（如患者飲食、用藥、基礎(chǔ)疾病等）對(duì)精密度驗(yàn)證造成的影響。濃度水平與廠家精密度評(píng)價(jià)時(shí)所用樣本的濃度高低均相差1次方，但更符合實(shí)驗(yàn)室常見陽(yáng)性樣本濃度水平。驗(yàn)證結(jié)果顯示，批內(nèi)精密度和批間精密度均遠(yuǎn)小于廠家聲明值（5%）和ISO 15189標(biāo)準(zhǔn)（7.5%）。

正確度驗(yàn)證可分為以下兩種方法：① 采用患者樣本與其他檢驗(yàn)方法或試劑盒進(jìn)行正確度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，此方法適用于未參加室間質(zhì)評(píng)的項(xiàng)目認(rèn)可；② 用參考物質(zhì)進(jìn)行正確度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，參與各級(jí)室間質(zhì)評(píng)的認(rèn)可項(xiàng)目均可采用此法進(jìn)行正確度驗(yàn)證［6］。本實(shí)驗(yàn)室丙肝核酸檢測(cè)項(xiàng)目參與國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委臨床檢驗(yàn)中心全國(guó)室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)。由使用相同檢測(cè)系統(tǒng)，或相同檢驗(yàn)方法，或相同試劑盒的實(shí)驗(yàn)室形成同方法組。采用此類室間質(zhì)評(píng)血清樣本，其均值可作為有權(quán)威的賦值（理論值）。本文參照2016年度第2次室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，上報(bào)檢測(cè)均值，檢驗(yàn)中心回饋結(jié)論為合格通過(guò)。對(duì)照回饋賦值，本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)值偏倚均在±0.4 log值的標(biāo)準(zhǔn)要求內(nèi)［5］。

臨床收集高濃度水平血清樣本（N×108kU/L），10倍倍比稀釋，形成理論值在101～108的梯度。檢測(cè)顯示，在N×102～N×108kU/L時(shí)線性良好，R2＝0.999，P＜0.01。與廠家聲明的線性范圍在低限上一致，高限上要高1次方。業(yè)界有關(guān)臨床可報(bào)告范圍的驗(yàn)證［9-11］，實(shí)際為檢測(cè)下限的驗(yàn)證。本文檢測(cè)下限驗(yàn)證的前期操作與線性范圍一致，確定最低稀釋梯度。最后再對(duì)最低梯度樣本進(jìn)行1：2稀釋，重復(fù)檢測(cè)20次（20次是小樣本統(tǒng)計(jì)分析的最低要求）［12］。結(jié)果顯示，在 102級(jí)的檢出率為 100%，偏倚在合理范圍內(nèi)，但在101級(jí)的檢測(cè)結(jié)果不確定，重復(fù)性差。說(shuō)明檢測(cè)下限為1.0×102kU/L，低于此限的定量檢測(cè)結(jié)果將變得不可靠。有學(xué)者認(rèn)為，由此可確定最大稀釋度為106，所以臨床可報(bào)告范圍可定為 1.0×102～1.0×1014kU/L［11］。我們認(rèn)為這樣確定稀釋上限的意義不大，因?yàn)榕R床上幾乎無(wú)法遇到HCV-RNA拷貝數(shù)為1014級(jí)的血清標(biāo)本，且再高的上限均可通過(guò)稀釋進(jìn)行分析，并不能說(shuō)明方法學(xué)的性能，檢測(cè)下限才是真正能反映該方法學(xué)的性能指標(biāo)。

操作人員首先應(yīng)全面領(lǐng)悟性能驗(yàn)證的含義，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作步驟爛熟于心，這樣才能熟練快捷地操作，不易犯錯(cuò)誤。分子實(shí)驗(yàn)多數(shù)進(jìn)行的是微量實(shí)驗(yàn)，極小的動(dòng)作誤差就有可能造成結(jié)果的千差萬(wàn)別。本研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均在幾次摸索中才得以成功。PCR分子檢測(cè)項(xiàng)目不同于其他專業(yè)的檢測(cè)項(xiàng)目，其試劑成本高、檢測(cè)過(guò)程繁瑣、涉及多種操作步驟、某些特殊項(xiàng)目的陽(yáng)性標(biāo)本稀缺，對(duì)實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，方法學(xué)驗(yàn)證需要花費(fèi)更大的人力和財(cái)力［12-13］。值得注意的是，處理核酸定量數(shù)據(jù)時(shí)要注意一定的技巧，在統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí)，應(yīng)明確將初始濃度值進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。我們同時(shí)用原始濃度值和由原始濃度值與對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化得到的數(shù)據(jù)計(jì)算精密度和線性范圍，統(tǒng)計(jì)結(jié)果出現(xiàn)偏差，這也與文獻(xiàn)報(bào)道一致［7，14］。

綜上，本實(shí)驗(yàn)室基于QIA cube全自動(dòng)核酸提取儀與ABI 7500核酸擴(kuò)增儀的HCV-RNA定量檢測(cè)系統(tǒng)所用試劑盒性能卓越，能夠完全滿足臨床對(duì)HCV核酸的定量檢測(cè)要求。本研究同時(shí)也為業(yè)界提供了一份符合ISO 15189醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可準(zhǔn)則的關(guān)于HCV核酸定量檢測(cè)的性能驗(yàn)證方案。