奶牛乳房炎主要致病菌耐藥性研究進(jìn)展

邢萌茹，劉慧敏，孟璐，董蕾，鄭楠，韓榮偉，王加啟

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，北京 100193；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266109；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（北京），北京 100193）

0 引 言

奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖過程中最普遍和最重要的疾病之一[1]。奶牛乳房炎主要是由多種病原菌所引起的，一般情況下奶牛乳房炎最高發(fā)病率在第五次哺乳期左右，約為26%，是危害奶牛生產(chǎn)的一種多發(fā)病[2]。全世界約有1/3的奶?；加腥榉垦?，是造成牛奶產(chǎn)量、質(zhì)量降低以及奶牛死亡和淘汰率增加的重要原因，會造成牛場嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。美國每年每頭奶牛約需花費(fèi)182美元用于治療乳房炎，每年約損失20億美元[3]。澳大利亞乳品行業(yè)每年因乳房炎影響乳品質(zhì)量而產(chǎn)生的損失超過1.3億美元[4]。

目前，國內(nèi)外多使用抗生素藥物對奶牛乳房炎進(jìn)行治療，牛場用藥不規(guī)范極易導(dǎo)致抗生素的亂用和濫用，從而導(dǎo)致不同程度的致病菌耐藥及抗生素藥物殘留。長期不規(guī)范使用抗生素治療乳房炎可能會導(dǎo)致抗生素耐藥菌株的出現(xiàn)，對奶牛乳房炎疾病的治療帶來影響，耐藥菌株也有一定幾率進(jìn)入人類的食物鏈當(dāng)中對人體健康造成危害[5-7]。本文對奶牛乳房炎的危害、主要致病菌的耐藥現(xiàn)狀及耐藥機(jī)制、耐藥性檢測方法以及抗生素耐藥性的防治措施等方面進(jìn)行綜述，旨在為奶牛乳房炎的治療和新型抗生素的開發(fā)提供參考。

1 奶牛乳房炎的分類及危害

1.1 分類

奶牛乳房炎是乳房在受到物理、化學(xué)因素等致病因子的刺激、多種微生物感染以及機(jī)械性損傷而導(dǎo)致奶牛乳房及乳頭出現(xiàn)炎癥變化，產(chǎn)生紅腫、熱痛等現(xiàn)象的一種疾?。ㄒ妶D1[8]）。根據(jù)奶牛乳房和乳汁的變化情況，美國乳房炎聯(lián)合會（National Mastitis Council,NMC）將乳房炎分為臨床乳房炎和亞臨床乳房炎，臨床乳房炎可以看見明顯的乳房和乳汁變化，包括乳房紅腫、乳汁稀薄發(fā)黃有絮狀物產(chǎn)生等現(xiàn)象；亞臨床乳房炎也稱隱性乳房炎，不表現(xiàn)臨床癥狀，可通過體細(xì)胞計數(shù)（Somatic Cell Count,SCC）、乳汁電導(dǎo)率檢測（Electrical Conductivity,EC）或加州乳房炎試驗（California Mastitis Test,CMT）等來診斷。此外根據(jù)其病原菌的來源分為傳染性乳房炎和環(huán)境性乳房炎，微生物是導(dǎo)致牛乳房炎的主要原因，對奶牛來說，很多導(dǎo)致乳房炎產(chǎn)生的病原體都是常見的，通常會出現(xiàn)在奶牛乳頭或者飼養(yǎng)環(huán)境中，從乳頭管進(jìn)入并移動到乳房。

圖1 牛乳房炎發(fā)病因素[8]

1.2 危害

奶牛患乳房炎后會引起牛場的成本增加，主要是病牛的治療、牛奶品質(zhì)降低、奶牛提前淘汰等[9]。臨床乳房炎能夠被飼養(yǎng)人員觀察到產(chǎn)奶減少、牛奶質(zhì)量下降等明顯變化，可以盡早進(jìn)行治療避免產(chǎn)生更嚴(yán)重的損失。而隱性乳房炎因無明顯臨床反應(yīng)，不易被察覺，因此不能及時治療，是造成經(jīng)濟(jì)損失的主要原因[10]。無論是臨床乳房炎或隱性乳房炎均會造成乳房損傷，使得這些奶牛面臨淘汰或死亡的風(fēng)險。波蘭有36.7%的奶牛因金黃色葡萄球菌和真菌感染而患有隱性乳房炎面臨淘汰[11]，在我國也有報道稱50%以上的奶牛患有乳房炎[12-13]。微生物感染引發(fā)的牛乳房炎會導(dǎo)致牛奶中的致病菌數(shù)量增加，可能直接或間接傳染給人類，引起食物中毒現(xiàn)象，對消費(fèi)者安全也造成極大影響。

2 牛乳房炎主要致病菌及耐藥狀況

2.1 主要致病菌

病原菌的感染是引起牛乳房炎的主要原因?？偣灿?00多種微生物可引起乳房炎，這些微生物可分為常見病原體（包括主要病原體和次要病原體）以及非常見病原體，常見病原菌約有20多種[14]。如表1所示，主要病原體中包括歸屬為傳染性病原菌的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）和支原菌（Mycoplasma spp.）（大部分為牛支原體（Mycoplasma bovis）），以及歸屬為環(huán)境性病原菌的大腸菌群（包括大腸桿菌（Escherichia coli）和克雷伯菌屬（Klebsiella spp.））、乳房鏈球菌（Streptococcus uberis）和停乳鏈球菌（Streptococcus dysgalactiae），化膿隱秘桿菌（Arcanobacterium pyogenes）、凝固酶陰性葡萄球菌（Coagulase negative staphylococcus）和牛棒桿菌（Corynebacterium bovis）等是次要病原體，此外酵母菌（Yeast）、真菌、腸球菌屬（Enterococcus spp.）、芽孢桿菌屬（Bacillus cohn）、沙雷氏菌屬（Serratia spp.）和原壁菌屬（Prototheca）等為非常見病原體[15-18]。有報道提出，次要病原菌如牛棒桿菌或凝固酶陰性葡萄球菌引起的奶牛乳房炎感染可以幫助抵抗主要病原菌導(dǎo)致的乳房炎的發(fā)生[18]。

表1 牛乳房炎主要病原菌

據(jù)報道，付靜濤等[15]對北京某郊區(qū)奶牛場的隱性乳房炎奶樣主要病原菌進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果顯示傳染性病原菌以金黃色葡萄球菌（規(guī)模牛場、小區(qū)和散養(yǎng)戶分別為9.98%、15.99%和11.96%）為主，環(huán)境性病原菌以停乳鏈球菌（小區(qū)高達(dá)10.41%）、沙雷氏菌（小區(qū)高達(dá)31.51%）和大腸桿菌為主。Bi等[16]檢測了894份中國不同地區(qū)的乳房炎樣品，其中檢出傳染性病原菌分別包括50.1%、92.2%和72.3%中的金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和停乳鏈球菌，檢出環(huán)境病原菌包括28.6%、8.9,%、35.7%、20.0%、1.3%、17.0%和67.2%的大腸桿菌、乳房鏈球菌、腸球菌屬、克雷伯氏菌屬、粘質(zhì)沙雷氏菌、牛棒狀桿菌和化膿桿菌，并且內(nèi)蒙古、黑龍江和河北不同地區(qū)的奶樣之間的病原菌檢出存在明顯差異；此外Bouari等[18]收集了羅馬尼亞204份乳房炎奶樣，其中檢出葡萄球菌54.9%、鏈球菌屬20.1%、大腸桿菌10.78%、克雷伯氏菌屬8.34%、芽孢桿菌屬5.88%，此外在62.7%的樣本中，最常見的關(guān)聯(lián)是由葡萄球菌-鏈球菌代表。綜上可知，目前國內(nèi)外乳房炎奶樣中流行率較高的是金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌屬等。

2.2 國內(nèi)外牛乳房炎主要致病菌耐藥現(xiàn)狀

奶牛乳房炎的治療主要使用抗生素，而在不明確病原菌及其耐藥史的情況下濫用或不合理使用抗生素，極易產(chǎn)生耐藥菌株，嚴(yán)重影響治療效果。

2.2.1 金黃色葡萄球菌耐藥現(xiàn)狀

金黃色葡萄球菌屬于葡萄球菌屬，是導(dǎo)致奶牛臨床乳房炎最主要的細(xì)菌之一。治療過程中抗生素的使用很容易使其產(chǎn)生耐藥性甚至形成多重耐藥，且抗生素耐藥性一旦形成則很難根除。Zhang等[40]在2016年的報告中分析了江蘇省200例乳房炎奶樣，分離出58株（分離率29.0%）金黃色葡萄球菌，其中有11株是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin Resistant Staphylococcus aureus,MRSA），耐藥結(jié)果顯示氨芐青霉素和青霉素的耐藥率最高（91.4%），其次是環(huán)丙沙星（53.4%），對頭孢噻吩和萬古霉素全敏感，有55株金葡菌分離株（94.8%）對至少一種抗生素具有耐藥性，約22.4%（n=13）的分離株對5種以上抗生素具有耐藥性。

Aslanta等[41]檢測了從土耳其南部330頭患有亞臨床乳房炎的奶牛中采集的牛奶樣本，分離出了112株金黃色葡萄球菌，在其中發(fā)現(xiàn)5株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，檢出率為4.5%；青霉素耐藥率為45.5%，氨芐青霉素39.3%，恩氟沙星和阿莫西林-克拉維酸的耐藥率最低（0.9%），對萬古霉素和慶大霉素全部敏感。Martini等[42]分析了巴西米納斯吉拉斯州的6個市中分離得到的90株乳房炎源金黃色葡萄球菌，其中69株（76.7%）耐氨芐青霉素，75株（83.3%）耐青霉素，64株（71.1%）耐四環(huán)素。

2.2.2 大腸桿菌耐藥現(xiàn)狀

大腸桿菌也是全世界牛乳房炎的主要致病因素之一，通常與急性臨床乳腺炎有關(guān)，感染周期較短，通常為1～2天，會造成嚴(yán)重?fù)p失。Pehlivanoglu等[43]從土耳其地中海沿岸的安塔利亞市的750個乳房炎奶樣中分離出的三株大腸桿菌，對氨基糖苷類（包括慶大霉素，卡那霉素和鏈霉素），喹諾酮類（包括環(huán)丙沙星，恩氟沙星，和萘啶酸），氯霉素，四環(huán)素和5種β-內(nèi)酰胺類（包括氨芐青霉素，頭孢喹啶，頭孢噻呋，頭孢呋辛和頭孢噻吩）均耐藥，對頭孢西丁、氟苯尼考和亞胺培南敏感。Hinthong等[44]從泰國薩拉布里省采集了38份乳房炎奶樣，分離出26株大腸桿菌，其對頭孢類耐藥率為18.2%，氨基糖苷類耐藥率為18.2%，β-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合耐藥率為5.2%，氟喹諾酮耐藥率為14.3%以及碳青霉烯類為1.3%，84.6%（22/26）的菌株表現(xiàn)出多重耐藥性。武軍元等人[45]對新疆阿克蘇地區(qū)的85份疑似患乳房炎病牛的奶樣中大腸桿菌進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示對氨芐西林的耐藥率最高（50.0%），對多西環(huán)素、四環(huán)素和鏈霉素的耐藥率次之（40.0%），對環(huán)丙沙星、氧氟沙星和氟苯尼考的耐藥率最低（15.0%）。

2.2.3 鏈球菌屬耐藥現(xiàn)狀

在引起牛乳房炎的所有微生物中，鏈球菌屬是與乳腺內(nèi)感染（Intramammary Infection,IMI）相關(guān)的較大微生物群體，并且與臨床和亞臨床乳房炎相關(guān)[46]。鏈球菌屬主要包括無乳鏈球菌、乳房鏈球菌和停乳鏈球菌，它們都是導(dǎo)致奶牛乳房炎的主要病原菌。Vélez等[47]通過全基因組測序（Whole-Genome Sequencing,WGS）研究了加拿大樣品中分離出的66株乳房鏈球菌的耐藥性，結(jié)果顯示在兩株分離株中都發(fā)現(xiàn)了11種抗生素耐藥基因。Boonyayatra等人[48]分析了56株來自泰國清邁的亞臨床乳腺炎和臨床乳腺炎奶樣無乳鏈球菌分離株，檢測了其對氨芐青霉素、氯沙西林、頭孢氨芐、慶大霉素和四環(huán)素的耐藥性，并提出耐藥機(jī)制假設(shè)（1）通過生物膜降低抗生素的滲透；（2）降低生物膜細(xì)胞的生長速度，減少抗生素的影響；（3）產(chǎn)生“持續(xù)”生物膜細(xì)胞遺傳突變?yōu)楦吣退幮?。相較國外而言，國內(nèi)關(guān)于鏈球菌導(dǎo)致牛乳房炎的報道較少。杜琳等[49]檢測了內(nèi)蒙古不同地區(qū)的298份隱性乳房炎病牛奶樣，分離得到22株無乳鏈球菌，四環(huán)素的耐藥率最高（77.3%），而對青霉素G、萬古霉素、紅霉素等抗生素，敏感率從90%～100%不等。Ding等[50]分析了內(nèi)蒙古地區(qū)360份臨床乳房炎奶樣，試驗結(jié)果顯示共分離出81株鏈球菌（22.5%），其中包括無乳鏈球菌57株（70.4%）、乳房鏈球菌15株（18.5%）和停乳鏈球菌9株（11.1%）；所有分離株均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，其中β-內(nèi)酰胺類耐藥率最高，分別為青霉素（95%）、阿莫西林（91.4%）、氨芐青霉素（81.5%）、頭孢拉定（86.4%）和頭孢噻吩（85.2%），有50%以上的菌株對紅霉素、克林霉素和四環(huán)素耐藥，沒有全部敏感的菌株，有14株分離株表現(xiàn)出多重耐藥，其中有3株耐7種以上抗生素。

2.2.4 其他致病菌耐藥現(xiàn)狀

除了常見的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及鏈球菌以外，其他致病菌導(dǎo)致牛乳房炎也時有報道。早在1980年，Gitter等人[51]就從乳房炎奶樣中分離出單增李斯特氏菌。Sambyal等[52]對來自查謨和周邊的295份樣品進(jìn)行分析（包括乳房炎奶樣110份和乳制品185份），從奶樣中分離出3株單增李斯特氏菌，分離率為2.7%，所有分離株對阿莫西林+舒巴坦、氨芐青霉素、紅霉素和恩氟沙星、左氧氟沙星、慶大霉素敏感，對阿米卡星、頭孢氨芐、頭孢匹肟、頭孢呋辛和氨曲南耐藥。Taponen等[53]則報道了芬蘭的29969頭奶牛中有四分之一確定為乳房炎感染，感染病原菌包括凝固酶陰性葡萄球菌（CNS）、金黃色葡萄球菌、乳房鏈球菌、乳酸鏈球菌、牛棒桿菌和大腸桿菌等6種。Ghazy等人[54]收集了150份乳房炎奶樣，從中分離出20株銅綠假單胞菌（13.3%），這些菌株對9種供試抗生素均表現(xiàn)耐藥，包括環(huán)丙沙星（5.0%），萬古霉素（6.7%），頭孢噻肟鈉、慶大霉素、阿莫西林-克拉維酸、氨芐西林、磺胺甲惡唑、氯霉素和丙甲菌素（10.0%）。由此可見，隨著對奶牛乳房炎研究的不斷深入，越來越多病原微生物表現(xiàn)出的不同耐藥情況被發(fā)現(xiàn)。

3 耐藥機(jī)制

抗生素是國內(nèi)外治療奶牛乳房炎的重要藥物，自從發(fā)現(xiàn)抗生素以來，其耐藥性便被人們所發(fā)現(xiàn)并警惕其存在[55]?？股氐拿苤幵谟谕ㄟ^使用可以抑制感染，但亦會使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，耐藥性可通過不同方式進(jìn)行傳播，甚至直接抵消其長期療效[56]。目前關(guān)于微生物耐藥機(jī)制的研究主要分為遺傳學(xué)機(jī)制和生化機(jī)制。

細(xì)菌遺傳學(xué)耐藥機(jī)制分為固有耐藥（Intrinsic resistance）和獲得性耐藥(Acquired resistance)。固有耐藥又稱天然耐藥，由細(xì)菌自身攜帶的耐藥基因決定，且具有穩(wěn)定的遺傳特性，一般不會改變。獲得性耐藥則是在長期使用抗生素后，細(xì)菌通過自發(fā)突變和水平基因轉(zhuǎn)移獲得專門的耐藥基因以保證自身生存。一旦獲得了耐藥基因或突變，細(xì)菌可以在抗生素存在下繼續(xù)生長，而敏感細(xì)菌的生長停止[56]，如果抗生素的壓力解除，那么這些耐藥基因?qū)⒆孕邢蛘哂杉?xì)菌的非染色體轉(zhuǎn)化為可遺傳因子，最終形成固有耐藥。可轉(zhuǎn)移遺傳因子包括質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子等。質(zhì)粒（Plasmid）是最早發(fā)現(xiàn)的除細(xì)菌染色體以外的一種獨(dú)立的、可自我復(fù)制的遺傳元件，其特性導(dǎo)致可在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移并傳播耐藥基因[57]，質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制中編碼喹諾酮耐藥性的質(zhì)粒pMG252的EcoRI的酶切片段（見圖2）[58]。轉(zhuǎn)座子（Transposon）是一段可以從基因組的一個位點(diǎn)移動至另一個位點(diǎn)的DNA序列，它是比質(zhì)粒更小的DNA片段，可以攜帶耐藥基因在細(xì)菌不同的基因組之間“跳躍”，從而導(dǎo)致耐藥性的多樣化[59,60]。研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌的耐藥基因通常位于轉(zhuǎn)座子或質(zhì)粒的基因元件——整合子（Integron）上，是一類對耐藥基因進(jìn)行天然整合和表達(dá)的載體，且隨著轉(zhuǎn)座子或質(zhì)粒的移動而轉(zhuǎn)移[61-62]。除此以外融合偶聯(lián)元件（Integrating conjugative elements,ICEs）也是在細(xì)菌群體中傳播抗生素耐藥性基因的移動遺傳因子，可以通過細(xì)胞-細(xì)胞接觸轉(zhuǎn)移并整合耐藥基因至新宿主的染色體中，譬如SXT是源于霍亂弧菌的ICE并編碼賦予氯霉素、磺胺甲惡唑、甲氧芐啶和鏈霉素等抗生素耐藥基因，“SOS反應(yīng)”增強(qiáng)了SXT轉(zhuǎn)移所必需的基因表達(dá)[63]（見圖3）。

圖2 編碼喹諾酮耐藥性的質(zhì)粒pMG252的Eco RI的酶切片段圖

圖3 SOS反應(yīng)增強(qiáng)SXT轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)途徑模型

細(xì)菌耐藥的生化機(jī)制包括：（1）酶解作用。當(dāng)抗生素進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞后，細(xì)菌可以產(chǎn)生使抗生素結(jié)構(gòu)破壞的滅活酶或鈍化酶，使其不能發(fā)揮抑菌作用，圖4為β-內(nèi)酰胺酶在青霉素到達(dá)革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)膜中的PBP靶位點(diǎn)之前將其水解[64]；（2）細(xì)胞壁通透性的改變和主動外排機(jī)制。細(xì)菌細(xì)胞壁上的孔蛋白是抗生素進(jìn)入細(xì)胞的“通道”，蛋白質(zhì)的主動外排系統(tǒng)有時會將抗生素排出胞外，如果孔蛋白基因突變使自身降低其表達(dá)，也可導(dǎo)致細(xì)菌對抗生素的耐藥性增強(qiáng)[65]。如圖5所示，四環(huán)素或紅霉素等抗生素通過外排泵蛋白排出細(xì)胞外，維持胞內(nèi)藥物濃度低于治療水平[64]；（3）藥物作用靶位改變。當(dāng)細(xì)菌上能與抗生素結(jié)合的靶位點(diǎn)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，抗生素?zé)o法與細(xì)菌結(jié)合也會使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。通過對耐藥機(jī)制產(chǎn)生的原因進(jìn)行簡單分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌耐藥是由于內(nèi)源性基因的突變，以及外源耐藥性決定因子的基因轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的[66]。

圖4 抗生素通過由耐藥細(xì)菌制成的酶進(jìn)行化學(xué)修飾來破壞

圖5 抗生素通過細(xì)胞壁外排泵蛋白排出細(xì)胞外

微生物耐藥性的產(chǎn)生除基因轉(zhuǎn)移或突變和生化機(jī)制外還存在生物膜的產(chǎn)生引起耐藥的情況。生物膜（Biofilm）是指附著于生物或非生物表面的微生物群落，生物膜內(nèi)的細(xì)胞被包裹在自產(chǎn)基質(zhì)中[67]。根據(jù)最近的全基因組分析結(jié)果表明，包括人類腸道和土壤等在內(nèi)的許多自然生態(tài)系統(tǒng)，都含有大量的基因，其功能可以被選擇賦予抗生素耐藥[68]。自然界中的細(xì)菌均可在一定條件下形成生物膜，這是細(xì)菌在自然條件下在物體表面生長時形成的一種自我保護(hù)狀態(tài)[69]。生物膜的形成可以減少抗生素的進(jìn)入并使其水解，從而提高耐藥能力，生物膜基質(zhì)的組分可以形成機(jī)械屏蔽，也可抑制抗生素作用，例如在銅綠假單胞菌生物膜中產(chǎn)生的Pel和Psl多糖可提高抗生素耐藥性[70]。

4 耐藥性檢測方法

在使用抗生素治療乳房炎的過程中，耐藥菌株特別是多重耐藥菌株的出現(xiàn)給乳房炎的有效防治帶來了巨大的挑戰(zhàn)?？焖偾覝?zhǔn)確地開展耐藥性的檢測對控制細(xì)菌感染、臨床合理用藥提供參考，為保證奶牛健康養(yǎng)殖，提高奶及奶制品質(zhì)量安全以及保障消費(fèi)者健康提供研究基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。目前，國內(nèi)外在微生物藥物敏感性試驗方面主要參照美國臨床試驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會（CLSI）推薦的《抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》（Performance standards for antimicrobial susceptibility testing），該標(biāo)準(zhǔn)最新版本是2017年一月份更新的M 100-S27[71]。在該標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定進(jìn)行藥敏試驗的傳統(tǒng)方法包括紙片擴(kuò)散法、肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法3種，藥敏試驗結(jié)果應(yīng)報告為敏感（S）、中介（I）、耐藥（R），其中最常使用的是紙片擴(kuò)散法。對三種傳統(tǒng)方法進(jìn)行比較，紙片擴(kuò)散法的可重復(fù)性好、操作簡便，但是易出現(xiàn)假耐藥，并且受人為因素影響[72]；肉湯稀釋法可精確測定最低抑菌濃度，但經(jīng)驗依賴性強(qiáng)、耗時長、無法肉眼判定微量肉湯法中是否存在雜菌[73]；而瓊脂擴(kuò)散法的優(yōu)點(diǎn)是重復(fù)性好、可肉眼觀測是否有雜菌，缺點(diǎn)是費(fèi)時費(fèi)力[74]。除此以外還有在稀釋法與擴(kuò)散法基礎(chǔ)上建立的新型耐藥性檢測方法——E-test法[75,76]和快速測定方法——全自動微生物鑒定/藥敏分析系統(tǒng)[77]，E-test法重復(fù)性好、檢測方便可試驗所需試紙條成本高，快速測定法相對而言更簡便、快速、受人為影響小且可靠性高，但是儀器昂貴不利于普及。

近年來，利用分子生物學(xué)技術(shù)直接對細(xì)菌的耐藥基因進(jìn)行檢測的方法也被廣泛使用。與其他方法相比，PCR法是基于微生物中耐藥基因的分子檢測方法，具有快速、高效等特點(diǎn)。常見的PCR耐藥性檢測方法包括多重PCR以及實時熒光定量PCR。Pyatov等人[78]使用多重PCR測定了捷克共和國乳房炎奶樣中分離出的病原菌的（包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、乳房鏈球菌、無乳鏈球菌和無乳鏈球菌）耐藥基因，有氨基糖苷類[str(A)、str(B)]，磺胺類（sulI、sulII），四環(huán)素類[tet(A)、tet(B)、tet(K)、tet(M)、tet(O)]，大環(huán)內(nèi)酯類和林可酰胺類[msr(A)、erm(A)、erm(B)、erm(C)、mef(A/E)]，多重PCR耐藥檢測結(jié)果可用來替代或補(bǔ)充所述病原體中表型耐藥的結(jié)果。Steele等人[79]則用實時熒光定量PCR檢測哺乳期乳房炎奶樣中的乳房鏈球菌和金黃色葡萄球菌。Sartori等[80]開發(fā)了一種新的qPCR方法來檢測牛乳房炎病原體金黃色葡萄球菌B型。用PCR檢測方法與常規(guī)耐藥性檢測方法相比更省時、可靠，可是常見的PCR檢測方法均局限于已知的耐藥基因，無法發(fā)現(xiàn)新的基因[81]。用多重PCR以及實時熒光定量PCR固然檢測便捷，大大縮短了檢測時間，可是檢測局限于已知的耐藥基因和小批次樣本。

依托于第二代基因測序技術(shù)出現(xiàn)的全基因組分析極大的擴(kuò)展了對微生物耐藥情況的研究，并且可以預(yù)測耐藥性、解釋耐藥機(jī)制。Vélez等人[82]對91株乳房炎源乳房鏈球菌和停乳鏈球菌進(jìn)行了全基因組測序，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌基因組中存在23種獨(dú)特的抗生素耐藥基因序列。然而全基因組測序預(yù)測耐藥性需要高質(zhì)量的基因文庫作支持，無法對未知的耐藥基因進(jìn)行解析。因此，為了得到準(zhǔn)確的抗生素耐藥性以及耐藥機(jī)制，我們?nèi)孕枰獙?xì)菌的表型耐藥情況進(jìn)行檢測。表2為不同種類抗生素耐藥性檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較。

表2 牛乳房炎致病微生物抗生素耐藥性檢測方法優(yōu)缺點(diǎn)比較

5 耐藥性防控措施

準(zhǔn)確快速的檢測病原體以及確定其耐藥性有助于確定出有效的治療方法。為了避免奶牛乳房炎病原菌產(chǎn)生更強(qiáng)的耐藥性，我們應(yīng)該積極主動進(jìn)行預(yù)防，從而避免牛乳房炎疾病的出現(xiàn)。

首先，應(yīng)對飼養(yǎng)者和管理者展開針對奶牛健康養(yǎng)殖方面的知識和技術(shù)培訓(xùn)，避免因飼養(yǎng)管理不當(dāng)造成感染；其次，要定期檢測奶牛健康水平，避免罹患隱性乳房炎的奶牛因未察覺而感染牛群，減少奶牛應(yīng)激反應(yīng)；最重要的是要對養(yǎng)殖環(huán)境衛(wèi)生進(jìn)行嚴(yán)格消毒殺菌，從源頭消除感染源。除此以外，在乳房炎疾病多發(fā)季節(jié)應(yīng)嚴(yán)密監(jiān)控牛群避免疾病發(fā)生。

針對已經(jīng)出現(xiàn)乳房炎源病原菌耐藥的牛群，建議首先采用廣譜抗生素控制病情，再通過藥物敏感性試驗結(jié)果針對性地使用抗生素治療，解決病原菌對原抗生素產(chǎn)生的耐藥性。而在對臨床患病奶牛進(jìn)行用藥之前，應(yīng)對奶牛感染的致病菌進(jìn)行分析鑒定，根據(jù)致病菌的情況科學(xué)用藥。

為了應(yīng)對日益嚴(yán)峻的奶牛乳房炎致病菌耐藥形勢，全球各個國家均建立了相關(guān)機(jī)構(gòu)來監(jiān)測乳品安全。1996年美國還成立了國家抗菌藥物耐藥性檢測系統(tǒng)（NARMS）用以監(jiān)測食源性致病菌的抗生素耐藥性，目前重點(diǎn)監(jiān)測的是沙門氏菌、彎曲桿菌屬、大腸桿菌和腸球菌[83]。歐洲耐藥性檢測系統(tǒng)始建于1998年，主要負(fù)責(zé)人醫(yī)、獸醫(yī)及食品的抗生素耐藥性監(jiān)測[84]。1998年澳大利亞也成立了抗生素耐藥性聯(lián)合專家技術(shù)咨詢委員會(Joint Expert Technical Advisory Committee on Antibiotic Resistance,JETA-CAR)，主要職責(zé)是評估可食用動物抗生素的使用以及監(jiān)測耐藥菌的出現(xiàn)和轉(zhuǎn)移[85]。國際乳品聯(lián)合會[86]（the International Dairy Federation,IDF）早在17年前便開始研究、審查及評估致病性大腸桿菌在乳品生產(chǎn)中的重要性的和對消費(fèi)者身體健康的影響[87]。2001年，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization,WHO）制定了《遏制微生物抗生素耐藥性全球戰(zhàn)略》，用以控制耐藥菌的出現(xiàn)和擴(kuò)散[88]。此外日本、韓國、加拿大、瑞典和挪威等國家也建立了抗菌藥物耐藥性監(jiān)測系統(tǒng)，用來控制甚至消除抗生素耐藥性問題。我國細(xì)菌耐藥監(jiān)測系統(tǒng)起步較晚始建于2005年，2008年覆蓋全國的細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)（MOH National Antimicrobial Resistance Investigation Net，Mohnarin）成立并開始監(jiān)測動物源細(xì)菌耐藥性[89]，2017年2月農(nóng)業(yè)部正式頒布了《2017年動物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測計劃》并在全國范圍內(nèi)開展對動物源細(xì)菌耐藥性的監(jiān)測工作[90]。

綜上所述，國內(nèi)外細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)的日益完善和強(qiáng)化，關(guān)于乳房炎奶樣中致病菌耐藥性監(jiān)測力度也進(jìn)一步加大，這對于預(yù)防和控制奶牛乳房炎有著重要意義。

展 望

奶牛乳房炎病原菌越來越高的耐藥率已經(jīng)引起了世界各國的廣泛關(guān)注，然而我國在相關(guān)領(lǐng)域的研究仍有一定差距。今后我國乳房炎耐藥性的研究應(yīng)該主要集中在乳房炎源細(xì)菌耐藥機(jī)制及產(chǎn)毒能力、特異性菌株全基因組測序分析，并形成相關(guān)的風(fēng)險評估報告，建立切實可行的預(yù)警防控體系等幾方面。此外還應(yīng)該關(guān)注臨床治療中抗生素的規(guī)范使用，為提升乳房炎的治療效果提供參考。