基于熒光定量PCR法鑒定嬰幼兒配方羊奶粉中牛源性成分

酈娟，董華夏，張珣，曾慧君，戴小芳，向春燕，楊永

（武漢食品化妝品檢驗(yàn)所，武漢 430012）

0 引 言

羊乳具有優(yōu)越的營養(yǎng)價值、易于吸收，在部分歐洲部分國家被視為營養(yǎng)佳品。歐洲鮮羊奶的售價是牛奶的好幾倍[1]，雖然羊奶在國內(nèi)產(chǎn)銷的市場份額比較小，但是羊奶粉的價格普遍高于牛奶粉。在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動下,羊乳中摻入牛乳的現(xiàn)象時有發(fā)生，且呈現(xiàn)日趨嚴(yán)重的趨勢。這不僅制約了羊奶產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展,更有可能威脅到消費(fèi)者的生命安全。羊乳中αs1-酪蛋白含量遠(yuǎn)低于牛乳[2]，而αs1-酪蛋白被認(rèn)為是牛乳主要的過敏原[3]。很多消費(fèi)者選擇羊乳是因?yàn)閷εＨ檫^敏，若在羊乳中摻雜牛乳，對牛乳過敏人群誤食有可能會威脅生命。

2016年10月實(shí)施的《嬰幼兒配方乳粉產(chǎn)品配方注冊管理辦法》在其第三章第三十一條中，明確規(guī)定了“產(chǎn)品名稱中有動物性來源的，應(yīng)當(dāng)根據(jù)產(chǎn)品配方在配料表中如實(shí)標(biāo)明使用的生乳、乳粉、乳清(蛋白)粉等乳制品原料的動物性來源”[4]。從保障我國消費(fèi)者權(quán)益與食品安全，以及加強(qiáng)我國食品安全監(jiān)管部門的監(jiān)督能力的角度出發(fā)，嬰幼兒配方羊乳粉中牛源性成分的快速檢測方法的建立具有重大意義。目前的檢測方法多是基于羊乳和牛乳中蛋白質(zhì)的差異，比如等電點(diǎn)聚焦電泳[5]、高效液相色譜技術(shù)[6]、酶聯(lián)免疫等[7]。由于乳粉生產(chǎn)工藝復(fù)雜，要經(jīng)過高溫過程，蛋白質(zhì)性質(zhì)會發(fā)生改變，再加上方法操作復(fù)雜，對人員要求較高，使得這些方法在日常檢測中的應(yīng)用受到限制。

本方法通過比較幾種乳粉DNA抽提方法，分別以線粒體DNA的細(xì)胞色素氧化酶b亞(Cytb)和線粒體DNA12SrRNA為目標(biāo)基因，以熒光定量PCR方法鑒別嬰幼兒配方羊奶粉中牛源性成分。最終建立以線粒體DNA12SrRNA為目標(biāo)基因，用熒光定量PCR的方法鑒定嬰幼兒配方羊奶粉中牛源性成分的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：不同品牌嬰幼兒配方牛乳粉和羊乳粉（后文簡稱牛乳粉和羊乳粉），作為引物及探針特異性檢測用的小麥、腰果、榛子、燕麥、牛肉、羊肉、豬肉、雞肉和鴨肉均為市售。

主要試劑：細(xì)胞組織基因組DNA提取試劑盒（天根），磁珠法動物基因組DNA抽提試劑盒（上海生工），柱式深加工產(chǎn)品基因組DNA抽提試劑盒（上海生工）、2×Taq PCRmix。

1.2 主要儀器

微量核酸蛋白質(zhì)定量儀(Nanodrop ND2000)，熒光定量PCR儀(BIO-RAD CFX 96 TOUCH)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

樣品前處理。稱取乳粉100 mg，加入600μL dd H2O進(jìn)行充分溶解，混勻，13 000 rpm/min離心5 min，用滅菌槍頭小心去除上層脂肪層和上清液，留下沉淀。后續(xù)操作按照各抽提試劑盒說明書進(jìn)行，細(xì)胞組織基因組DNA提取試劑盒方法稱為方法1，磁珠法動物基因組DNA抽提試劑盒稱為方法2，柱式深加工產(chǎn)品基因組DNA抽提試劑盒成為方法3。

1.3.2 DNA濃度檢測

將提取得到的DNA用微量核酸蛋白質(zhì)定量儀測量OD值，若OD260／OD280介于1.8至2.0之間，DNA濃度達(dá)到50～200ng/μL則可滿足試驗(yàn)要求。

1.3.3 熒光定量PCR檢測

引物和探針。通過查閱資料和BLAST比對確定引物及探針，包括針對牛和羊線粒體DNA細(xì)胞色素氧化酶b亞基的bovine-cytb和goat-cytb、針對牛和羊線粒體DNA12SrRNA的bovine-12SrRNA和goat-12SrRNA引物探針組合，具體見表1。

反應(yīng)參數(shù)如下。

bovine-cytb-Taqman和goat-cytb-Taqman引物探針組合的熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃3 min，1個循環(huán)，95℃15 S，60℃1 min，40個循環(huán)，同時收集熒光。反應(yīng)體系：模板DNA100 ng，2×Taq PCRmix 12.5μL，引物各0.5μL（10μmol/L），探針1μL（10 μmol/L），加無菌雙蒸水補(bǔ)足至25μL。同時設(shè)置反應(yīng)試劑空白對照（以水代替模板DNA）和陽性對照。

bovine-12SrRNA-Taqman和goat-12SrRNATaqman引物探針組合的熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃2 min，1個循環(huán)，95℃15 S，60℃30 s，40個循環(huán)，同時收集熒光。反應(yīng)體系：模板DNA100ng，2×Taq PCRmix 12.5μL，引物各0.5μL（10μmol/L），探針1μL（10μmol/L），加無菌雙蒸水補(bǔ)足至25μL。同時設(shè)置反應(yīng)試劑空白對照（以水代替模板DNA）和陽性對照。

表1 各種成分檢測引物與探針序列

2 結(jié)果與分析

2.1 引物探針的特異性

以牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、玉米、腰果、榛子、燕麥DNA為模板，用bovine-cytb-Taqman、goat-cytb-Taqman、bovine-12SrRNA-Taqman和 goat-12SrRNA-Taqman分別進(jìn)行擴(kuò)增，goat-cytb-Taqman和goat-cytb-Taqman只對羊肉DNA有擴(kuò)增，bovine-cytb-Taqman和bovine-12S rRNA-Taqman只對牛肉DNA有擴(kuò)增，說明擴(kuò)增均具有特異性。

2.2 不同方法抽提乳粉DNA結(jié)果

將用不同試劑盒法提取好的牛乳粉的DNA稀釋10倍，使用核酸蛋白濃度測定儀對樣品DNA進(jìn)行測定，按照bovine-cytb-Taqman方法檢測牛源性成分檢測，具體結(jié)果見表2。

表2 不同方法提取牛乳粉DNA質(zhì)量結(jié)果

根據(jù)4個乳粉樣品的檢測結(jié)果可見，本實(shí)驗(yàn)中方法1和方法2抽提牛乳粉DNA的效果好于方法3。用方法1和方法2抽提羊乳粉DNA，按照goat-cytb-Taqman方法檢測羊源性成分檢測，具體結(jié)果見表3。

表3 不同方法提取羊乳粉DNA質(zhì)量結(jié)果

可見，方法1抽提乳粉DNA的效果比方法2和3好，按照方法1進(jìn)行后續(xù)乳粉DNA抽提。

2.3 熒光定量PCR方法靈敏度比較

以bovine-cytb-Taqman和 bovine-12SrRNATaqman方法擴(kuò)增同樣的牛乳粉DNA，比較兩種方法的Ct值，結(jié)果檢表4。

以goat-cytb-Taqman和goat-12SrRNA-Taqman方法擴(kuò)增同樣的羊乳粉DNA，比較兩種方法的Ct值，結(jié)果檢見表5。

表4 兩種乳粉中牛源性成分檢測方法靈敏度比較

表5 兩種乳粉中羊源性成分檢測方法靈敏度比較

可見，以bovine-12SrRNA-Taqman和goat-12SrRNA-Taqman方法檢測乳粉中的牛和羊源性成分，具有較高的靈敏度。

2.4 實(shí)際樣品的檢測

收集20份嬰幼兒配方羊乳粉。采用前述方法1抽提DNA。以goat-12SrRNA-Taqman方法鑒定乳粉中羊源性成分，以bovine-12SrRNA-Taqman方法鑒定乳粉中的牛源性成分。

2.4.1 判定標(biāo)準(zhǔn)

若目標(biāo)成分檢測結(jié)果Ct值≤30.0，判定為檢出相應(yīng)成分。若目標(biāo)成分檢測結(jié)果Ct值＞30.0，判定為未檢出相應(yīng)成分。

2.4.2 樣品檢測結(jié)果

20份嬰幼兒配方羊奶粉中均檢出羊源性成分，2份未檢出牛源性成分，18份檢出牛源性成分（見表6）。

3 結(jié) 論

乳粉的加工過程復(fù)雜，還含有脂肪等很多其他成分，而得到高質(zhì)量的DNA是利用熒光定量PCR方法進(jìn)行成分鑒定的重要前提。這使得鑒定乳粉中的源性成分比鑒定鮮乳中的源性成分困難[8]。通過比較，發(fā)現(xiàn)將去脂肪的前處理步驟與現(xiàn)有商品化試劑盒抽提方法結(jié)合起來，可以快速簡便得到滿足熒光定量PCR檢測要求的DNA。

本研究以牛、羊線粒體DNA 12SrRNA為目標(biāo)基因，建立了快速檢測嬰幼兒配方羊乳粉中牛源性成分的熒光定量PCR方法。對20個嬰幼兒配方羊奶粉進(jìn)行檢測，結(jié)果僅有2個樣品為純羊奶粉，18個樣品檢出牛源性成分。而18個檢出牛源性成分的嬰幼兒配方羊乳粉中僅有2個在標(biāo)簽標(biāo)識中標(biāo)明了其脫鹽乳清粉和乳清蛋白粉為牛源性，其余樣品未標(biāo)識源性。

羊乳粉中摻入牛源性成分，一般分為兩種情況，一是直接添加牛乳粉，一種是以牛乳清粉代替羊乳清粉摻入羊乳粉。牛α-乳白蛋白、牛β-乳球蛋白可以作為鑒別羊乳粉中是否添加牛乳清蛋白的標(biāo)志物。目前正在嘗試以牛α-乳白蛋白和牛β-乳球蛋白為目標(biāo)基因，用熒光定量PCR的方法檢測是否是由于牛乳清蛋白的摻入造成的。今后從α-乳白蛋白和β-乳球蛋白入手，可以進(jìn)一步分析出羊乳粉是如何摻入牛源性成分，更利于監(jiān)管工作。

表6 嬰幼兒配方羊乳粉實(shí)際樣品檢測結(jié)果及標(biāo)簽標(biāo)識信息