固相微萃取-氣相色譜法結(jié)合感官評(píng)價(jià)建立液態(tài)乳在物流中酸敗的預(yù)測(cè)方法

楊帥，陳成，郭曉雅，程蕾，車會(huì)蓮

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)特殊食品研究中心食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

0 引 言

隨著人民生活水平日益提高，液態(tài)乳制品逐漸成為人們?nèi)粘Ｉ钪械闹匾煞?。液態(tài)乳制品中的游離脂肪酸作為乳制品的風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)其品質(zhì)有重要影響[1]。但是在生產(chǎn)加工、物流過(guò)程中液態(tài)乳受外界環(huán)境的影響會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)成分發(fā)生改變，牛奶中固有的或由噬冷微生物產(chǎn)生的脂肪酶釋放游離脂肪酸（FFA），使牛奶中產(chǎn)生酸敗、苦澀和不愉快氣味[2]。短鏈游離脂肪酸（主要是C4-C12）是酸敗風(fēng)味的主要成分，而長(zhǎng)鏈游離脂肪酸（C14-C18）與酸敗不相關(guān)。

對(duì)于液態(tài)乳制品脂肪酸檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[3]、高效液相色譜法[4-6]、滴定法、微生物檢測(cè)器檢測(cè)和固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法[7-9]等等，其中氣相色譜法應(yīng)用最廣泛。用氣相色譜法測(cè)定奶中脂肪酸時(shí)，通常采用衍生化方法，將脂肪提出后對(duì)脂肪酸甲酯化用氣相色譜儀分析[10]。但衍生化方法對(duì)測(cè)量奶中FFA時(shí)，短中鏈脂肪酸具有揮發(fā)性或半揮發(fā)性，易揮發(fā)影響測(cè)定結(jié)果。頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜法聯(lián)用（HS-SPME-GC/MS）技術(shù)以其快速、方便、高效的優(yōu)點(diǎn)，成為液態(tài)乳制品中游離揮發(fā)性物質(zhì)的常見(jiàn)定量檢測(cè)方法[11-12]。固相微萃取（HS-SPME）技術(shù)是一種無(wú)溶劑，集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體的樣品前處理新技術(shù)，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）可以實(shí)現(xiàn)對(duì)液態(tài)乳制品中風(fēng)味化合物的定量分析[13-14]。固相微萃取、氣相色譜等技術(shù)聯(lián)用可檢測(cè)香精[13]、羊奶[15]、茶葉[16]、花椒[8]、化妝品[17]中揮發(fā)性成分，在環(huán)境（農(nóng)藥殘留[18-19]）、石油等領(lǐng)域也有應(yīng)用。但在檢測(cè)液態(tài)乳游離脂肪酸時(shí)由于沸點(diǎn)低，在液態(tài)乳制品中含量少，在極性萃取頭上吸附能力相對(duì)較弱，影響萃取效率，而且SPME-GC/MS一般使用峰面積歸一法進(jìn)行半定量，得到的數(shù)據(jù)只是目的脂肪酸占所有風(fēng)味物質(zhì)的百分比，是一個(gè)比例數(shù)據(jù)，限制了方法的準(zhǔn)確性與精密度[20]。

牛奶味道溫和，任何異味的存在都很容易影響其原本的味道，為了避免物流過(guò)程中環(huán)境或人為原因?qū)е屡Ｄ贪l(fā)生異味，需要一種方便精準(zhǔn)的檢測(cè)程序，在液態(tài)乳產(chǎn)生異味之前測(cè)量其風(fēng)味前體、風(fēng)味成分等可能引發(fā)異味的風(fēng)險(xiǎn)因素。本研究利用固相微萃取和氣相色譜技術(shù)與感官評(píng)價(jià)結(jié)合建立了酸度值（ADV），F(xiàn)FA濃度和感官之間的聯(lián)系，通過(guò)逐步多元回歸分析，將定量感官數(shù)據(jù)與牛奶中單個(gè)短鏈FFA（C4-C12）相關(guān)聯(lián)，建立檢測(cè)和預(yù)測(cè)液態(tài)乳制品物流過(guò)程酸敗的分析方法。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

游離脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品（丁酸，己酸，辛酸，癸酸，十二烷酸，十四烷酸和十六烷酸），購(gòu)自Sigma；生牛奶,來(lái)自某奶牛場(chǎng)；市售的四個(gè)不同液態(tài)乳制品品牌的含3%脂肪的19種商業(yè)巴氏滅菌均質(zhì)乳制品，并保持在4℃。

1.2 儀器設(shè)備

固相微萃取器，其中萃取頭為50/30UM DVB/CAR on PDMS,購(gòu)于美國(guó)Supelco公司；GC5400氣相色譜儀；深圳天瑞ROHS儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 牛奶樣品的制備

將新鮮的巴氏滅菌奶5℃下孵育24 h以使酸敗發(fā)生。生奶在66℃下分批巴氏滅菌35 min，并迅速冷卻。將分批殺菌的生奶樣品在不同的小瓶中冷凍直到用于分析。通過(guò)將生奶的等分試樣與高品質(zhì)的新鮮巴氏消毒奶（5∶95，10∶90，15∶85，20∶80，25∶75，30∶70，35∶65，40∶60，45∶55和50∶50）混合制備具有不同酸度強(qiáng)度的樣品。根據(jù)感官和分析測(cè)試的要求制備混合物。通過(guò)混合兩種不同批次的脂解生奶和在四種不同場(chǎng)合收集的高品質(zhì)新鮮巴氏消毒牛奶，共制備了40個(gè)酸敗樣品。另外還分析了6個(gè)高品質(zhì)新鮮巴氏消毒均質(zhì)牛奶樣品。因此，共對(duì)46個(gè)樣品進(jìn)行化學(xué)和感官分析。

1.3.2 感官評(píng)估

挑選了12名感官評(píng)審員，均為非吸煙的正規(guī)牛奶消費(fèi)者，從12名初級(jí)評(píng)委中選出了5名評(píng)審小組成員。他們是四位女性和一位男性，年齡在25至46歲之間。小組成員的敏感性是通過(guò)測(cè)試其區(qū)分牛奶酸度的能力進(jìn)行確定的。五名小組成員確定牛奶酸敗的絕對(duì)或感官評(píng)價(jià)閾值。對(duì)應(yīng)于感官評(píng)價(jià)閾值的奶被標(biāo)記為特殊腐敗酸奶，并且在訓(xùn)練和感覺(jué)測(cè)試期間用來(lái)作為參考樣品。根據(jù)限制的方法，當(dāng)50%的評(píng)委同意給一個(gè)樣本同樣的感覺(jué)時(shí)，就確定了檢測(cè)閾值。當(dāng)用新鮮的巴氏滅菌均質(zhì)牛奶中15%制備的生奶樣品增加酸度，感官評(píng)審員品嘗出酸味，那就說(shuō)明用新鮮的巴氏滅菌均質(zhì)牛奶中15%制備的生奶樣品是引起酸敗所需的水平。

培訓(xùn)的開(kāi)始時(shí)先確定酸敗強(qiáng)度規(guī)模和參考標(biāo)準(zhǔn)的使用規(guī)則，用10分酸度強(qiáng)度量表進(jìn)行感官分析（從0=不可察覺(jué)到10=非常顯著）。用于培訓(xùn)和測(cè)試的樣品是如上所述制備的具有不同酸度強(qiáng)度的牛奶。在每個(gè)測(cè)試期間，小組成員都獲得了三個(gè)參考樣品，一個(gè)高質(zhì)量的新鮮牛奶，一種特異的酸奶（15∶85），其對(duì)應(yīng)于絕對(duì)或檢測(cè)閾值，以及極酸性牛奶（50∶50）。小組成員在品嘗不同樣品之間用水漱口，并以自由選擇的方式食用無(wú)鹽餅干，以清除口感。參考樣品的順序依次為0.0（新鮮牛奶），3.0（明顯的酸奶）和10.0（極酸性牛奶）。感官評(píng)分從0到2.9的樣品依次為∶非乳清乳，而得分≥3.0的樣品為酸奶。

1.3.3 固相微萃取-氣相色譜法

FFA通過(guò)SPME-GC分析測(cè)定了40個(gè)生奶樣品中的FFA，6個(gè)高品質(zhì)新鮮巴氏消毒奶樣品和19個(gè)商業(yè)巴氏消毒奶樣品。在密封的小瓶中，通過(guò)放置40 mL含有28%NaCl和戊酸，pH 1.5的酸（20ppm）作為內(nèi)標(biāo)牛奶收集揮發(fā)性，70℃平衡30 min，并將聚丙烯酸酯纖維暴露60 min，小瓶頂空。當(dāng)用硫酸將p H調(diào)節(jié)至1.5時(shí)，短鏈FFA釋放到頂部空間。吸附在纖維上的FFA在GC5400氣相色譜儀解析5 min，DB-FFAP毛細(xì)管柱分離。通過(guò)分析標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣品進(jìn)行初步鑒定。將新鮮的巴氏消毒牛奶儲(chǔ)備溶液（20 000 ppm）摻入FFA分析標(biāo)準(zhǔn)品中，制成終濃度為10，20，40和100ppm，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)FFA的校準(zhǔn)曲線。測(cè)定40個(gè)生奶樣品、6個(gè)高品質(zhì)新鮮巴氏消毒勻漿乳制品和19個(gè)商業(yè)巴氏殺菌勻漿乳制品的ADV值，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用Systat/Sygraph逐步多元線性回歸將實(shí)驗(yàn)室制備的具有不同酸度的46個(gè)樣品的FFA和相應(yīng)的酸敗風(fēng)味強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，因變量是感官評(píng)審的酸敗風(fēng)味強(qiáng)度得分，自變量是FFA的濃度，以百萬(wàn)分之一為單位。牛奶樣品類似地，ADV作為獨(dú)立地依賴變量和log（RSobs）分別進(jìn)行回歸分析其相關(guān)性，并將該方程與FFA基本方程進(jìn)行比較。為了評(píng)估進(jìn)行預(yù)測(cè)的回歸模型的準(zhǔn)確性，計(jì)算了19個(gè)商業(yè)乳制品的檢測(cè)值和預(yù)測(cè)值之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性

新鮮牛奶的ADV為0.6，在正常牛奶報(bào)告的范圍內(nèi)（ADV＜0.7）。酸奶（絕對(duì)檢測(cè)閾值）的ADV為2.1。感官訓(xùn)練是在正式測(cè)試之前，進(jìn)行22次的訓(xùn)練測(cè)試。通過(guò)將生奶的等分試樣與新鮮的巴氏消毒的均質(zhì)牛奶（0∶100,10∶90,15∶85,25∶75,35∶65和 50∶50）混合，制備了六種樣品，并進(jìn)行編號(hào)，每個(gè)樣品重復(fù)三次，然后對(duì)其進(jìn)行方差分析（表1），以確定評(píng)估小組和樣本之間的顯著差異。小組成員之間沒(méi)有顯著性差異（p＞0.01），表明感官評(píng)價(jià)結(jié)果穩(wěn)定可靠（表1）。

表1 感官小組成員評(píng)估方法分析總結(jié)

2.2 短鏈脂肪酸濃度與酸度感官評(píng)分顯著相關(guān)

分析SPME-GC檢測(cè)的FFA的含量與經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的感官小組評(píng)估的酸敗評(píng)分之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)室制備的不同程度酸敗的46個(gè)樣品的數(shù)據(jù)生成的回歸模型由下式表示：

感官評(píng)價(jià)小組確定的牛奶酸度與樣品中FFA的濃度呈正相關(guān)（p＜0.001，相關(guān)系數(shù)為0.84）。測(cè)量19種商業(yè)液態(tài)乳制品的FFA濃度，并使用方程式1計(jì)算預(yù)測(cè)的酸度分?jǐn)?shù)。根據(jù)感官分?jǐn)?shù)對(duì)應(yīng)，18個(gè)樣品被歸類為非酸敗奶，因?yàn)樗鼈兊姆謹(jǐn)?shù)對(duì)應(yīng)于新鮮，非酸性牛奶的特征范圍（0～2.9），只有樣品19被分類為明顯的酸敗奶，因?yàn)樗鼘?duì)應(yīng)感官評(píng)分3.0（表2）。通過(guò)基于FFA的模型預(yù)測(cè)感官評(píng)分時(shí)，測(cè)試的19個(gè)樣本的風(fēng)味分類與感官評(píng)估的酸敗分?jǐn)?shù)分類達(dá)成100%一致。將18個(gè)樣品分類為非酸敗奶，范圍為0至2.9，樣品19分類為明顯的酸敗奶，分?jǐn)?shù)為3.0（表2）。在這項(xiàng)工作中，發(fā)現(xiàn)游離脂肪濃度與酸度感官評(píng)分之間存在著十分顯著的相關(guān)性，也顯示了單個(gè)脂肪酸或脂肪酸組之間的相關(guān)性較低?？赡苁怯捎贔FA沒(méi)有完全回收，因?yàn)镕FA的回收率取決于p H值，1.3至3.0之間的低p H值來(lái)回收短鏈（C4-C8）脂肪酸。改變pH值的可以提供更佳的短鏈脂肪酸的回收率，并且與腐敗風(fēng)味具有更強(qiáng)的相關(guān)性。

2.3 ADV值和酸度感官評(píng)分存在相關(guān)性

該模型中使用的46種牛奶樣品的ADVs范圍為0.6至4.08，與觀察到的酸敗分?jǐn)?shù)（1.6～8.7）相對(duì)應(yīng)。為了確定這46個(gè)ADV數(shù)據(jù)與觀察到的酸敗評(píng)分（RSobs）之間的關(guān)系，生成了一個(gè)回歸模型，并擬合成(2)式。

表2 商業(yè)奶的游離脂肪酸(FFA)數(shù)據(jù)和酸度值（ADV）的方程的預(yù)測(cè)能力

對(duì)于該模型，獲得了兩者的相關(guān)系數(shù)為0.79，有顯著性意義（p＜0.001），表明由感官感知確定的牛奶酸度與ADV值相關(guān)。由于ADV＞1.0的奶是酸敗的，如果僅用ADV值對(duì)商業(yè)奶的風(fēng)味進(jìn)行分類，則除了樣品4和16之外，所有樣品都將分類為酸敗奶，因?yàn)樗鼈兊腁DV值均大于1.0。因此，在進(jìn)行酸敗評(píng)價(jià)時(shí)必須進(jìn)行感官評(píng)估，以確認(rèn)在具有高ADV的牛奶樣品中存在酸敗味，而僅根據(jù)其ADV沒(méi)有將其分為酸敗奶。

雖然ADV值和酸度感官評(píng)分之間存在高度相關(guān)性，但也存在差異，這些差異可能是由于脂肪酶釋放FFA的原因，來(lái)自生奶中甘油酯的脂肪酸水解主要是由加入均質(zhì)乳制品中的乳脂肪酶引起的。

4 結(jié)論

本研究建立的分析方法在乳品行業(yè)中可用于檢測(cè)和預(yù)測(cè)物流過(guò)程中液態(tài)乳制品的酸敗情況?；跍y(cè)定短鏈游離脂肪酸的技術(shù)與酸敗風(fēng)味高度相關(guān)，通過(guò)固相微萃取氣相色譜測(cè)定液態(tài)乳中短鏈游離脂肪酸與經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的感官小組測(cè)定的風(fēng)味評(píng)分結(jié)合檢測(cè)乳制品的酸敗情況，對(duì)于所測(cè)試的樣本，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為100%。但是儀器方法的校準(zhǔn)需要進(jìn)行感官評(píng)估，一旦建立了數(shù)學(xué)模型，即能簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確對(duì)未知樣品進(jìn)行客觀評(píng)估，而不需要感官評(píng)審人員的感官評(píng)價(jià)。該分析方法為乳制品質(zhì)量控制與檢測(cè)提供了有效的途徑。