白術中3種內酯成分的含量測定及指紋圖譜研究*

張 兵，張麗娜，韓鵬軍，黃 瑞，祁東利，劉志東

（1.天津中醫(yī)藥大學，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術教育部工程中心，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，天津 300193）

中藥白術為菊科植物白術（Atractylodesmacrocephala Koidz.）的干燥根莖。中醫(yī)認為白術味苦、甘，性溫。歸脾、胃經。具有健脾益氣，燥濕利水，止汗，安胎功效。用于脾虛食少，腹脹泄瀉，痰飲眩悸，水腫，自汗，胎動不安等癥[1]。近年來的研究表明白術具有抗炎、利尿、抗衰老、抑制腫瘤、促進胃腸運動、提高機體免疫力等作用[2-7]，同時對神經系統(tǒng)與子宮平滑肌也有一定調節(jié)作用[8-9]。2015年版中國藥典中僅收錄了白術飲片，并未指明其藥材、飲片的含量測定項。本文研究建立了白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量測定方法，對來自4個產地的12批次白術飲片進行了上述成分的含量測定，測定了白術飲片的指紋圖譜，并對結果進行聚類分析，以期為白術的質量標準研究提供依據(jù)和參考。

1 儀器與試藥

島津LC-20A液相色譜儀（日本島津公司），安捷倫1200LC-DAD液相色譜儀（美國安捷倫公司），XP205型十萬分之一天平（METTLER TOLEDO），F(xiàn)124型萬分之一天平（天津億諾科學儀器有限公司），Q-300B型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），Mill-QⅡ型超純水系統(tǒng)（Millipore公司），中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

白術內酯Ⅰ（天津中新藥業(yè)，Lot.No.:W10-3-1，純度≥98.0%）；白術內酯Ⅱ（天津中新藥業(yè)，Lot.No.:W13-4-9，純度≥98.0%）；白術內酯Ⅲ（天津中新藥業(yè)，Lot.No.:W09-9-8，純度≥98.0%）；乙腈為色譜級（天津康科德試劑有限公司）；水為超純水；白術飲片來源見表1。

表1 白術產地與批次

2 方法與結果

2.1 白術飲片中白術內酯含量測定

2.1.1 標準對照品儲備液制備 分別精密稱取白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對照品適量，加甲醇制成每1 mL含76.83、77.61、156.40μg的標準對照品儲備液。

2.1.2 供試品溶液制備 精密稱取樣品粉末（過5號篩）2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理（功率300 W，頻率45 kHz）30 min，取出，再稱質量，用甲醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（5μm,250 mm×4.6 mm），流動相為乙腈-水=50∶50（v/v），流速 1.0 mL/min，柱溫 30 ℃，進樣量10 μL，檢測波長 222 nm（白術內酯 I、III）[10-11]與278 nm（白術內酯 II）[10-14]。

2.1.4 線性關系考察 取各對照品溶液，用甲醇稀釋成系列濃度，按2.1.3中條件測定色譜峰面積，以標準品濃度（μg/mL）為橫坐標（X），色譜峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ回歸方程分別為：Y=44219X-1399.9（r2=0.9985），Y=57339X-1 035.3（r2=0.999 2），Y=27 654X-3 278.8（r2=0.996 9）；線性范圍分別為 0.015～0.768μg，0.016～0.776μg和0.031～1.594 μg。

2.1.5 精密度實驗 精密吸取安徽20150603批次白術飲片供試品溶液10μL，連續(xù)進樣6次，測定色譜峰面積，結果白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的RSD（n=6）分別為1.58%、2.28%和1.03%。數(shù)據(jù)表明本實驗精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性實驗 精密吸取安徽20150603批次白術飲片供試品溶液 10 μL，于 0、2、4、8、12、24 h分別進樣分析，測定色譜峰面積，結果白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的 RSD（n=6）分別為 1.46%、3.81%和0.96%。表明供試品溶液在制備后24 h內穩(wěn)定。

2.1.7 重復性實驗 精密稱取安徽20150603批次白術飲片粉末6份，每份2 g，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，精密吸取10μL進樣測定。結果白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的RSD分別為2.61%、2.35%和3.50%。結果表明方法重復性良好。

表2 白術飲片中白術內酯含量測定結果（%，n=2）

2.1.8 加樣回收實驗 取已知白術內酯含量的樣品粉末6份，每份1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入濃度為76.83μg/mL的白術內酯Ⅰ對照品溶液10 mL，濃度為77.61μg/mL的白術內酯Ⅱ對照品溶液3 mL，加入濃度為78.20μg/mL的白術內酯Ⅲ對照品溶液各6 mL，按2.1.2項下方法制備供試溶液，精密吸取10μL進樣測定，計算回收率。結果白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的平均回收率分別為100.98%，95.35%和95.23%，RSD分別為0.78%，2.40%和4.46%。結果表明方法加樣回收率結果良好。

2.1.9 樣品測定結果 分別取4個產地12批次白術樣品粉末，每個樣品取2份，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，精密吸取10μL進樣測定，樣品中白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量結果見表2。

2.2 白術飲片指紋圖譜的建立與測定

2.2.1 標準對照品溶液和供試品溶液制備 見2.1項下內容。

2.2.2 色譜條件 色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（5μm,250 mm×4.6 mm），流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫程序為：0～15 min，45%～55%A；15～20 min，55%A；20～40 min，55%～61%A；40～51 min，61%～69%A；51～80 min，69%～100%A；80～87 min，100%A；流速 1.0 mL/min，進樣量 10μL，柱溫 25℃，檢測波長220 nm。

2.2.3 精密度實驗 取供試品溶液，連續(xù)進樣6次，按2.2.2項下的色譜條件測定，以參比峰的保留時間和峰面積為參照，計算得供試品溶液中各共有峰相對保留時間的RSD為0.04%～2.61%，相對峰面積的RSD為0.59%～6.91%，表明儀器穩(wěn)定，儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液，在0、2、4、8、12、24、48 h按2.2.2項下的色譜條件測定6次。以參比峰的保留時間和峰面積為參照，計算得供試品溶液中各共有峰相對保留時間RSD在0.003%～1.82%，相對峰面積的RSD在1.09%～7.58%，表明供試品溶液在48 h內穩(wěn)定。

2.2.5 重復性實驗 取6份供試品溶液，按2.2.2項下的色譜條件測定。以參比峰的保留時間和峰面積為參照，計算得供試品溶液中各共有峰相對保留時間的RSD為0.00%～0.08%，相對峰面積的RSD為1.46%～6.28%，表明方法重復性好。

2.2.6 樣品的測定和指紋圖譜的建立 取標準對照品溶液和12批白術供試品溶液，分別進樣10μL，液相測定。將色譜數(shù)據(jù)導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）”，7號峰峰面積最大且穩(wěn)定，故選擇作為參比峰（S），以A1圖譜為校正參照，時間窗寬度設為1.0 min，建立12批次白術飲片指紋圖譜疊加圖，見圖1，確定10個共有峰，得到白術飲片共有峰指紋圖譜（R），每批樣品與R比較，計算12批樣品的指紋圖譜相似度，其相似度在0.972～0.998之間，見表3。

圖1 白術飲片的指紋圖譜疊加圖和共有峰圖譜（R）

表3 12批白術指紋圖譜相似度

2.2.7 系統(tǒng)聚類分析 以12批白術飲片中的3種成分含量、10種共有成分的相對峰面積為變量，采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對樣品進行聚類分析。采用利差平方和法（Ward法），以歐氏距離平方作為樣品測度，聚類樹狀圖見圖2。

由系統(tǒng)聚類樹狀圖可以看出，12批白術飲片樣品被分為4類，與白術飲片產地具有較好的一致性，根據(jù)聚類分析的結果可大致判斷白術飲片的產地。

圖2 白術飲片聚類分析

3 討論

分析4個產地12批次白術飲片中白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量結果，發(fā)現(xiàn)白術內酯的單一成分含量和3個成分總含量的高低順序具有一致性，各產地飲片中白術內酯含量由高至低依次為浙江、河北、湖南、安徽，而這可能與其產地、生長年限、環(huán)境、采收加工等因素有關。

在指紋圖譜相似度評價中，4個產地12批次白術飲片指紋圖譜與共有峰R圖譜的相似度在0.972～0.998之間。其中A8樣品（浙江20150701）的相似度最低（0.972），這可能是該樣品中白術內酯總量最高所造成的。

在系統(tǒng)聚類分析中，A7～A9樣品被分為一類，表明該產地（浙江）白術飲片不同批次之間質量均一性良好，這與其內酯類含量在4個產地中最高的含量測定結果和最低的指紋圖譜相似度結果相一致。而A4與A5、A1與A3各被分至一類，表明這兩個產地（安徽、湖南）的白術飲片質量較為均一。

高效液相色譜法含量測定結合指紋圖譜分析與系統(tǒng)聚類分析的評價方法，適用于中藥質量控制與評價。在本實驗中，通過三者結合的方法，在一定程度上表征了不同產地不同批次白術飲片在化學成分方面的共性與差異，并大致區(qū)別出了白術飲片的產地，基于三者的綜合信息，可以為白術飲片質量控制與評價提供參考。