通竅散瘀方微乳的制備及評價*

賈 山，張紫薇，譚佳威，楊 冰，白 潔，李鵬躍，杜守穎，陸 洋

（北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100029）

通竅散瘀方原方為王永炎院士臨床經(jīng)驗方，由葛根、白芍、薄荷腦等藥味組成，用于治療急性腦中風，療效確切。方中主要成分有葛根素、芍藥苷和薄荷腦。主要藥效成分為葛根素、芍藥苷。葛根素具有擴張冠狀動脈、抗心肌缺血，抑制血小板凝集、改善腦循環(huán)[1]、對腦缺血及缺血再灌注引起的神經(jīng)細胞損傷具有保護作用[2-3]。芍藥苷對腦神經(jīng)元有保護作用[4]，薄荷腦在一定濃度范圍內(nèi)能夠促進葛根素的滲透，當濃度達到5 mg/mL時具有顯著促滲作用[5]。通竅散瘀方在臨床上主要以水煎液給患者。而方中主要藥效成分葛根素在水和油中的溶解度都很低[6]，提高葛根素的生物利用度非常必要。為了發(fā)揮該方速效急救的臨床療效，研制一種安全穩(wěn)定并使有效成分能夠直達腦部的劑型非常必要。微乳作為一種新型的納米制劑，具有腦靶向、低刺激性和高穩(wěn)定性的特點。

本研究首先通過偽三元相圖制備通竅散瘀方微乳，并對其理化性質(zhì)、含量、刺激性進行評價。

1 材料

儀器LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津公司，SPD-M20A，PDA檢測器；LCSolution色譜工作站）；磁力攪拌器（金壇區(qū)華城潤華實驗儀器廠）；激光粒徑測定儀（Zetasizer Nano ZS，英國馬爾文儀器有限公司）；TK-20B型透皮擴散試驗儀（上海皆凱科技貿(mào)易有限公司）；葛根素提取物（北京普博欣生物科技有限責任公司，批號PB10624-1）；芍藥苷提取物（北京普博欣生物科技有限責任公司）；薄荷腦提取物（北京普博欣生物科技有限責任公司，批號PB31210）；葛根素對照品（110752-201615）；芍藥苷對照品（110736-201441）；肉豆蔻酸異丙酯IPM（麥克林）；油酸乙酯（北京化工廠）；油酸（北京化工廠）；蓖麻油聚氧乙烯35（阿達瑪斯試劑公司）；辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯（labrasol）（嘉法獅（上海）貿(mào)易有限公司）等；SD大鼠，雄性，體質(zhì)量（180～220）g[北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司許可證編號：SCXK（京）2006-2009]。

2 方法與結(jié)果

2.1 葛根素在各油相、乳化劑、助乳化劑中的溶解度考察

2.1.1 色譜條件 十八烷基鍵合硅膠柱；甲醇-水（37∶63）（1%醋酸）；流速 1.0 mL/min；檢測波長：250 nm，柱溫：25℃，進樣量：20μL。

2.1.2 標準曲線的繪制 精密稱取葛根素對照品適量，用甲醇溶解并稀釋成濃度為613.000、367.800、122.600、61.300、24.520、2.452 μg/mL 的葛根素標準供試液。按照上述色譜條件，進樣20μL，記錄峰面積。以樣品色譜峰面積A對濃度C進行線性回歸，結(jié)果表明，葛根素在2.452～613μg/mL線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=51 121 441.36X-34 622.21，r2=0.999 9。

2.1.3 精密度實驗 取高、中、低質(zhì)量濃度（613、367.8、2.452 μg/mL），連續(xù)進樣 3 次，記錄峰面積，計算RSD值0.33%、0.17%、0.000 80%。表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性實驗 分別在2、4、6、8、10、12 h測樣品含量。計算RSD值，RSD值為1.79%，表明12 h內(nèi)樣品穩(wěn)定性良好。

2.1.5 溶解度實驗 測定葛根素在不同油相（IPM、油酸、油酸乙酯中）、不同乳化劑（EL-35、吐溫80、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯（Labrasol）、不同助乳化劑（1，2-丙二醇、無水乙醇、丙三醇、PEG400、Transpol p（二乙二醇單乙基醚））中的溶解度。室溫下，在足量的葛根素中，分別加入5 mL的各溶媒，攪拌48 h，使藥物充分溶解。在 3、9、12、24、48 h 取點，每次取300μL。然后于5 000 r/min下離心15 min，精密量取上清液100μL，甲醇定容到10 mL，HPLC測定葛根素含量。結(jié)果見1～2。

結(jié)果顯示，對于油相，IPM、油酸、油酸乙酯，葛根素在其中的溶解度均小于0.1 mg/g，說明葛根素在油中的溶解度很低，因此選擇這3種油相作進一步的研究。葛根素在3種表面活性劑中的溶解度都大于40 mg/g，且大小差不多，因此選擇這3種乳化劑進行進一步的實驗。對于助乳化劑，葛根素在1，2-丙二醇的溶解度為254.83 mg/g，明顯高于在其他助乳化劑的溶解度。因此選擇這1，2丙二醇作為助乳化劑。

圖1 葛根素在不同乳化劑中的溶解度

圖2 葛根素在不同助乳化劑中的溶解度

圖3 微乳的偽三元相圖

2.2 微乳油相的篩選 精密稱取EL35作為乳化劑，1，2-丙二醇作為助乳化劑，乳化劑和助乳化劑按質(zhì)量比（Km）為1∶1混合均勻，制成混合乳化劑。將混合乳化劑分別與IP M、油酸乙酯、油酸，按質(zhì)量比 9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9 的比例精確稱量，置于西林瓶中，25℃恒溫，350 r/min磁力攪拌混合均勻，以去離子水滴定，每滴一次待其充分混合均勻，觀察液體的形態(tài)變化，同時以入射光照射，觀察是否有丁達爾現(xiàn)象，記錄體系的臨界變化點。計算臨界點時每個組分在微乳體系中的質(zhì)量百分含量，借助O-riginPro8.0軟件繪制微乳的偽三元相圖，確定O/W型微乳區(qū)。結(jié)果見圖3。

結(jié)果顯示，EL35-1，2丙二醇-IPM-水微乳區(qū)面積最大。微乳區(qū)面積大者，微乳的穩(wěn)定性較好。所以選擇IPM作為油相。

2.3 微乳乳化劑的篩選 精密稱取IPM作為油相，1，2-丙二醇作為助乳化劑、EL-35、吐溫 80、（Labrasol）為乳化劑，將各乳化劑和助乳化劑按質(zhì)量比（Km）1∶1，混合均勻，制成混合乳化劑。將不同的混合乳化劑與 IPM，按質(zhì)量比 9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9 的比例精確稱量，置于西林瓶中，后面的實驗操作同2.2。結(jié)果見圖4。

結(jié)果顯示，以Labrasol作乳化劑的處方，在任何比例下都不可形成微乳。而以EL35，吐溫80為乳化劑的微乳面積比較，EL35的微乳區(qū)面積大者，選擇乳化劑EL-35。

2.4 微乳Km值的篩選 精密稱取EL35作為乳化劑和1，2-丙二醇作為助乳化劑按質(zhì)量比（Km）為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3 分別混合均勻，制成混合乳化劑。將混合乳化劑與 IPM，按質(zhì)量比 9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8 和 1∶9 的比例精確稱量，置于西林瓶中，后面的實驗操作同2.2。結(jié)果見圖5。

結(jié)果顯示，當Km=1∶1時，微乳區(qū)面積最大，選擇 Km=1∶1。

圖4 不同微乳乳化劑的偽三元相圖

圖5 不同km值的偽三元相同

2.5 最佳空白微乳處方的篩選 在篩選出的以IPM為油相、EL-35為乳化劑、1，2丙二醇為助乳化劑，Km值為1∶1的偽三元相圖中，篩選13個點作進一步研究。乳化劑的用量一般為處方的40%～60%，油相為5%左右。

采用馬爾文激光粒徑測定儀，對已經(jīng)選擇的微乳區(qū)域內(nèi)的13個處方進行粒徑和多分散指數(shù)（PDI）測定。以形成微乳的外觀、粒徑、PDI作為衡量指標綜合考慮，選擇最佳處方配比，作為最優(yōu)處方。結(jié)果見表1。

結(jié)果顯示，處方2、處方5和處方13，外觀澄清透明，PDI小，比較穩(wěn)定。將這3個處方進行進一步實驗。

2.6 最佳載藥微乳處方的篩選 考察葛根素載藥量 500、600、700、800、900、1 000 mg葛根素。芍藥苷和薄荷腦按照處方比例添加到空白微乳處方中。處方比例為葛根素：芍藥苷：薄荷腦=2∶1∶0.8。將空白處方2，處方5和處方13加入各藥物之后，制得載藥微乳，在常溫下放置，處方13載藥500 mg在第2天析出，處方5載藥500 mg在第10天析出，處方2載藥 500、600、700 mg，放置不析出，根據(jù)最大載藥量原則，最終選擇載藥量700 mg。

2.7 通竅散瘀微乳處方設(shè)計 設(shè)計空白處方總量為 10 g，IPM 0.519 g，1，2-丙二醇 2.923 g，EL35 2.923 g，水3.635 g，其中載藥葛根素700 mg，芍藥苷280 mg，薄荷腦 350 mg。

2.7.1 通竅散瘀微乳制法 取10 mL西林瓶，按照處方比例依次加入1，2丙二醇、EL35、葛根素，25℃恒溫水浴，以350 r/min攪拌，使其充分溶解。加入薄荷腦、IPM。攪拌，使其充分溶解,作為A相。另取芍藥苷提取物加入相應(yīng)量的純凈水中攪拌使其充分溶解，作為B相。將B相逐滴加入A相中，不斷攪拌使混合均勻，即得。

2.8 通竅散瘀方微乳pH值測定 取3個批號的通竅散瘀方微乳各10 g，置于西林瓶中，將pH酸度計校正平衡后，測定3個樣品的pH值。

結(jié)果顯示，醒腦靜鼻用微乳的平均pH值為5.31，而正常生理狀態(tài)下，鼻腔內(nèi)pH值為4.5～6.5，在此PH值下，生物適應(yīng)性良好[7]。

2.9 微乳中葛根素和芍藥苷含量測定

2.9.1 色譜條件Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，柱溫 30℃；流動相乙腈-甲醇-水（15∶10∶75）；流速1.0 mL/min；葛根素檢測波長250 nm；芍藥苷檢測波長230 nm；進樣量10μL。

2.9.2 標準曲線的建立 分別精密稱取葛根素、芍藥苷對照品6.64、5.2 mg，加甲醇配制成葛根素濃度為0.066 4 mg/mL，芍藥苷濃度為0.013 mg/mL的對照品儲備液。配置成一系列葛根素濃度為66.40、33.20、16.60、8.30、6.64、3.32 μg/mL 的對照品溶液。芍藥苷濃度為 26.00、13.00、6.50、3.25、2.60、1.30 μg/mL，搖勻，得到標準溶液系列。按上述色譜條件依次進樣。以測得峰面積A與其濃度C線性回歸，得葛根素標準曲線方程Y=37 784 682.811 1X+22 121.591 5，r=0.999 4，線性范圍 3.32～66.40 μg/mL，芍藥苷標準曲線方程 Y=12863791.6530X+4071.5616，r=0.9994，線性范圍 1.300～26.00μg/mL。

2.9.3 專屬性考察

2.9.3.1 空白體系微乳的配制 精密稱取微乳1.0644g，15000r/min 離心 10min，取上清液，于 10mL容量瓶中，加甲醇定容。取1 mL加到25 mL，加甲醇定容。取1mL加到10 mL容量瓶中，加甲醇定容。

2.9.3.2 樣品溶液的配制 精密稱取微乳1.005 0 g，15 000 r/min離心10 min，取上清液，于10 mL容量瓶中，加甲醇定容。取1 mL加到25 mL，加甲醇定容。取1 mL加到10 mL容量瓶中，加甲醇定容。

2.9.4 精密度實驗 取同一對照品溶液，重復進樣6次。葛根素峰面積RSD=0.13%，芍藥苷RSD=0.40%，表明本實驗的方法精密度良好。

2.9.5 重現(xiàn)性實驗 取同一批樣品6份，分別制成供試品溶液，按含量測定法測定，結(jié)果葛根素，RSD=0.19，芍藥苷RSD=0.61，表明本實驗的方法重現(xiàn)性良好。

2.9.6 穩(wěn)定性考察 取載藥微乳溶液，按照供試品的處理方法制成待測液后，于 0、2、4、6、8、10、12、24 h進行測定，記錄峰面積值，葛根素RSD=0.17，芍藥苷RSD=0.74，表明供試品在處理后24 h保持穩(wěn)定。

2.9.7 載藥微乳的含量測定 取3批樣品，依供試品溶液的處理辦法制成供試品溶液，按照2.9.3項下進行測定，結(jié)果如下表2～3。

表2 載藥微乳中葛根素的含量

表3 載藥微乳中葛根素的含量

2.9.8 粒徑 采用激光散射法測定了空白微乳和載藥微乳的，取稀釋10倍的載藥微乳適量，用馬爾文粒徑儀測定自微乳的粒徑和Zeta電位，記錄粒徑及電位。載藥微乳的平均粒徑（直徑）為17.86 nm，PDI為0.031，Zeta電位為-4.90 mV。空白微乳的粒徑和電位與載藥微乳差異不大，結(jié)果見圖6～7。

圖6 載藥微乳的粒徑

圖7 載藥微乳的電位

3 通竅散瘀微乳對大鼠鼻黏膜和纖毛刺激性、損傷性作用及可逆性研究

大鼠共21只，隨機分為4組，其中載藥微乳組、空白微乳組、藥物混懸液組各6只，生理鹽水組3只。第1天給藥3次，每次給藥50μL，在給藥后的第2天和第8天分別處死3只大鼠（生理鹽水組第2天處死）。取鼻中隔軟骨（帶黏膜），蘇木精-伊紅（HE）染色，石蠟切片，做光鏡觀察，結(jié)果見圖8～9。

結(jié)果顯示，HE染色下生理鹽水組大鼠鼻粘膜病理切片中可見無上皮細胞無增生，排列整齊，杯狀細胞少，固有層無水腫。通竅散瘀微乳組病理切片可見上皮細胞的纖毛脫落，固有層水腫，腺體增生，血管不同程度擴張并略微充血。通竅散瘀微乳恢復1周組的大鼠病理切片大鼠鼻黏膜恢復正常。通竅散瘀藥液組大鼠鼻黏膜切片可見杯狀細胞增多，腺體增生，血管不同程度擴張并有充血現(xiàn)象。通竅散瘀藥液恢復1周組大鼠鼻黏膜未恢復正常，仍可見杯狀細胞增多，腺體增生，血管不同程度擴張并有充血現(xiàn)象。

圖8 給藥第2天倒置顯微鏡下觀察圖（40×）

圖9 給藥8天后倒置顯微鏡下觀察圖（40×）

4 討論

方中的葛根素是難溶性成分，提高葛根素溶解度很重要。首先采用溶解度實驗初步選出乳化劑、助乳化劑、油相，再以滴水法繪制偽三元相圖，單因素考察乳化劑、助乳化劑、油相，進一步篩選出合適的乳化劑、助乳化劑、油相。以粒徑、PDI為指標，確定乳化劑、助乳化劑、油相的比例。再以載藥量為指標，確定處方中各藥物的量，最終制備載藥微乳。

通竅散瘀微乳能顯著提高難溶性藥物葛根素的載藥量，并且形成均一穩(wěn)定的體系。可為通竅散瘀方給藥提供新的劑型。

通過大鼠鼻中隔切片實驗研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，以生理鹽水作為對照組，通竅散瘀微乳給藥后有一定毒性，然而在給藥1周后切片觀察，發(fā)現(xiàn)其纖毛再生，細胞在恢復，表明通竅散瘀微乳雖對大鼠鼻黏膜和纖毛產(chǎn)生刺激性，但其可以恢復。說明微乳對鼻腔的刺激性具有可逆性，可為通竅散瘀方給藥提供新的劑型。