血清4型I亞群禽腺病毒高免卵黃抗體的制備與應(yīng)用

魏中鋒 杜衛(wèi)賓 徐梅

摘要：本研究利用分離鑒定的FadV-4（SD株），制備FadV-4（SD株）油乳劑滅活疫苗并制備卵黃杭體，通過對(duì)該卵黃杭體的安全性和預(yù)防與治療效果進(jìn)行了研究，本研究的臨床試驗(yàn)結(jié)果表明卵黃杭體對(duì)FadV-4感染的預(yù)防保護(hù)率高達(dá)98.67%，對(duì)FadV-4感染的治療率高達(dá)97.33%，卵黃杭體對(duì)臨床中FadV-4的感染具有良好的預(yù)防與治療效果，可用于雞場(chǎng)雞安卡拉病的保健和治療。

關(guān)鍵詞：禽;腺病毒;卵黃抗體;制備;應(yīng)用

中圖分類號(hào)：S851 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-9737（2018）10-0001-03

由血清4型工亞群禽腺病毒（FadV-4）引起的雞安卡拉病是近年來在我國出現(xiàn)的以心包積液、包涵體肝炎為主要特征的一種急性、烈性傳染病，該病傳播速度快、病死率高，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于目前尚無特效治療藥物，多數(shù)養(yǎng)殖單位采用抗病毒藥物來預(yù)防與治療雞安卡拉病，浪費(fèi)巨大人力和物力的同時(shí)也導(dǎo)致預(yù)防和治療效果并不理想。卵黃抗體（IgY）又稱為卵黃免疫球蛋白，是血液中的特異性抗體在卵細(xì)胞中逐漸蓄積而形成，將卵黃中的抗體經(jīng)過提取處理后即可用于相應(yīng)疾病的預(yù)防和治療，且具有成本低、產(chǎn)量高、安全高效、性能穩(wěn)定、可規(guī)模化連續(xù)生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，克服了血清抗體（IgG）成本高、非特異性反應(yīng)、無法連續(xù)生產(chǎn)等缺點(diǎn)，近年來在動(dòng)物疫病防控中得到了廣泛應(yīng)用[1]。

1 材料

1.1 毒株與疫苗

FadV-4（SD株）由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存;FadV-4（SD株）油乳劑滅活疫苗由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

無疫病感染史和禽腺病毒免疫史的健康產(chǎn)蛋雞30只購自菏澤市軍英養(yǎng)殖場(chǎng);300只健康A(chǔ)A+自羽肉仔雞由菏澤興君種禽場(chǎng)提供。

1.3 主要試劑

辛酸均購自成都東金化學(xué)試劑廠;白油購自淄博嘉馳石油化工有限公司;硬脂酸鋁、司本-80、吐溫-80均購自成都東金化學(xué)試劑廠。

2 方法

2.1 產(chǎn)蛋雞的免疫

基礎(chǔ)免疫，取產(chǎn)蛋雞20只，于腿部肌肉多點(diǎn)注射FadV-4（SD株）油乳劑滅活疫苗0.2mL/只。加強(qiáng)免疫，于首免后21天進(jìn)行二免，腿部肌肉多點(diǎn)注射FadV-4 （SD株）油乳劑滅活疫苗0.3mL/只。強(qiáng)化免疫，于二免后21天進(jìn)行三免，腿部肌肉多點(diǎn)注射FadV-4 （SD株）油乳劑滅活疫苗0.5mL/只。維持免疫，于三免后每隔60天進(jìn)行維持免疫，腿部肌肉多點(diǎn)注射FadV-4 （SD株）油乳劑滅活疫苗0.5mL/只。同時(shí)取10只產(chǎn)蛋雞作為對(duì)照組，同時(shí)于腿部肌肉多點(diǎn)注射同劑量的滅菌生理鹽水。

2.2 雞血清FadV-4杭體效價(jià)監(jiān)測(cè)

于首次免疫后7天、14天、21天、28天、60天、120天、180天分別對(duì)所有試驗(yàn)雞于翅靜脈采集血清1.0mL，常規(guī)方法分離血清。以10倍濃縮的FadV-4（SD株）滅活抗原為檢測(cè)抗原，采用瓊脂擴(kuò)散方法分別測(cè)定免疫組和對(duì)照組蛋雞的血清抗體效價(jià)（1092）。

2.3 雞蛋FadV-4杭體效價(jià)監(jiān)測(cè)

于首次免疫后7天、14天、21天、28天、60天、120天、180天分別采集免疫組和對(duì)照組的雞蛋，將蛋殼表面用酒精棉球擦拭清潔，打開蛋殼，取出蛋黃，加入2倍體積的滅菌生理鹽水，震蕩混合均勻后加入等體積的氯仿，震蕩混合均勻，12000 r/min離心10min后，吸取上清液即得卵黃抗體。以10倍濃縮的FadV-4（SD株）滅活抗原為檢測(cè)抗原，采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法分別測(cè)定免疫組和對(duì)照組蛋雞的卵黃抗體效價(jià)。

2.4 卵黃抗體的制備

采集瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法測(cè)定抗體效價(jià)在5log₂以上的雞蛋，將雞蛋浸入0.1%二氯異氰尿酸鈉水溶液中消毒15min，打破蛋殼，除去蛋清、胚盤和系帶，分離卵黃。將卵黃移至滅菌容器內(nèi)，加入其7倍體積的醋酸鹽緩沖液（0.12 mol/L，pH值5.0），攪拌混合均勻，將pH值調(diào)至5.2，置2-8℃靜止過夜。次日吸取上清液，緩慢攪拌加入辛酸至終濃度為1.5%，攪拌混合均勻，置2～8℃靜止過夜。次日取上清液，將pH值調(diào)至7.2。取卵黃液經(jīng)0.45μm濾膜過濾澄清，在濾液中緩慢滴人甲醛至甲醛溶液終濃度為0.05%，于室溫滅活24h，分裝后2～8℃保存。

2.5 卵黃杭體的檢驗(yàn)

按照《中華人民共和國獸藥典》三部2015年版（中國獸藥典委員會(huì)編，2015）中的方法進(jìn)行無菌檢驗(yàn)、物理性狀檢驗(yàn)、甲醛殘留量測(cè)定、辛酸殘留量測(cè)定、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)、安全性檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)和抗體效價(jià)檢測(cè)等常規(guī)檢驗(yàn)。同時(shí)進(jìn)行雛雞預(yù)防保護(hù)試驗(yàn)。

2.6 臨床應(yīng)用效果研究

2.6.1 卵黃抗體對(duì)FadV-4的預(yù)防效果

將300只3日齡健康A(chǔ)A+自羽肉仔雞隨機(jī)分成2組（對(duì)照組和免疫組），每組150只雞，免疫組每只肉仔雞皮下注射卵黃抗體0.5mL，對(duì)照組每只肉仔雞皮下注射滅菌生注射FadV-4 （SD株）病毒液，0.1mL/只，隔離飼養(yǎng)，觀察至14天，統(tǒng)計(jì)各組雞的發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)，分析卵黃抗體對(duì)肉仔雞人工感染FadV-4的預(yù)防效果。

2.6.2 卵黃抗體對(duì)FadV-4感染肉仔雞的治療效果

將300只3日齡健康A(chǔ)A+自羽肉仔雞隨機(jī)分成2組（對(duì)照組和治療組），每組150只雞，對(duì)照組和治療組雞均腿部肌肉注射FadV-4（SD株）病毒液，0.1mL/只，注射后3天，治療組每只肉仔雞皮下注射卵黃抗體0.5mL，對(duì)照組每只肉仔雞皮下注射滅菌生理鹽水0.5mL，隔離飼養(yǎng)，觀察至14天，統(tǒng)計(jì)各組雞的死亡數(shù)和治愈數(shù)，分析卵黃抗體對(duì)肉仔雞人工感染FadV-4的治療效果。

3 結(jié)果

3.1 免疫雞血清抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果

如圖1所示，在疫苗免疫后，免疫組蛋雞血清FadV-4抗體效價(jià)逐漸提高，至首次免疫后90天抗體效價(jià)達(dá)到峰值（8.1log2 ），隨后開始維持在一定水平，至免疫后180天，F(xiàn)adV-4抗體效價(jià)仍維持在7.5log2以上。

3.2 免疫雞卵黃抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果

如圖2所示，在疫苗免疫后，免疫組蛋雞卵黃中FadV-4抗體效價(jià)逐漸提高，至首次免疫后90天抗體效價(jià)達(dá)到峰值（7.2log2 ），隨后開始維持在一定水平，至免疫后180天，抗體消長規(guī)律與卵黃抗體消長規(guī)律基本一致，但卵黃抗體的增長趨勢(shì)較血清抗體遲3～5天，且峰值水平較血清抗體約低1個(gè)滴度，這可能是血清中抗體逐步轉(zhuǎn)移至卵黃的結(jié)果。

3.3 卵黃杭體的檢驗(yàn)

3.3.1 常規(guī)檢驗(yàn)結(jié)果

按照《中華人民共和國獸藥典》三部2015年版中的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，卵黃抗體無菌生長;卵黃抗體為淡黃色澄明液體，久置后具有少量白色沉淀;卵黃抗體的甲醛殘留量為0.091%;卵黃抗體的辛酸殘留量<0.1%辛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液A440;無支原體生長;無外源病毒污染;注射卵黃抗體未引起1日齡SPF雞的任何局部或全身不良反應(yīng);采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法測(cè)定卵黃抗體的抗體效價(jià)為6log2。

3.3.2 雛雞預(yù)防保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

如表1所示，對(duì)照組雞在攻毒后，先后表現(xiàn)出食欲減退、精神萎靡等臨床表現(xiàn)，至攻毒后5天，攻毒對(duì)照組10只雞已全部死亡，剖檢死亡雞可見心包積液以及肝臟出血、腫大、變性、壞死等FadV-4感染的典型病理變化。卵黃抗體組雞在攻毒后14天內(nèi)均未表現(xiàn)出食欲減退、精神萎靡等臨床表現(xiàn)，至14天，將試驗(yàn)雞宰殺、解剖，內(nèi)臟器官未見任何病理變化。表明卵黃抗體0.5mL的免疫劑量在免疫后5天內(nèi)能完全保護(hù)FadV-4強(qiáng)毒株的攻擊，卵黃抗體的預(yù)防效果較好。

3.4.1 卵黃抗體對(duì)FadV-4的預(yù)防效果

如表2所示，免疫5天后，攻擊FadV-4（SD株），觀察至14天，卵黃抗體免疫組的150只肉仔雞存活148只，對(duì)照預(yù)防保護(hù)率高達(dá)98.67%。表明本研究制備的卵黃抗體能夠有效預(yù)防臨床中FadV-4的感染。

3.4.2 卵黃抗體對(duì)FadV-4感染肉仔雞的治療效果

如表3所示，人工感染FadV-4（SD株）3天后，分別注射滅菌生理鹽水和卵黃抗體作為治療藥物，觀察至14天，卵黃抗體治療組的150只肉仔雞存活146只，對(duì)照組的150只肉仔雞死亡147只，卵黃抗體對(duì)FadV-4感染的治療率高達(dá)97.33%。表明本研究制備的卵黃抗體對(duì)臨床中FadV-4的感染具有良好的治療效果。

4 討論

4.1 卵黃抗體的優(yōu)越性

卵黃抗體（IgY）又稱為卵黃免疫球蛋白，是禽類血清中免疫球蛋白G（IgG）移行至卵黃中形成的多克隆抗體[2]，本研究的卵黃抗體化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，與血清抗體相比較具有成本低、易于制備、可規(guī)模化生產(chǎn)、可連續(xù)性生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，其通過被動(dòng)免疫可使免疫動(dòng)物獲得堅(jiān)實(shí)的保護(hù)力，是疫病預(yù)防和治療的良好獸用生物制品，在動(dòng)物疫病防控中將具有廣闊的應(yīng)用前景。

4.2 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)方法的建立

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）是通過可溶性抗原與相應(yīng)抗體在瓊脂凝膠中自由擴(kuò)散，當(dāng)抗原和抗體發(fā)生特異性反應(yīng)后形成肉眼可見的自色沉淀線，如抗原和抗體不發(fā)生特異性反應(yīng)則不會(huì)出現(xiàn)沉淀線，可用于抗原或抗體的定性檢測(cè)[3]。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)為經(jīng)典的抗原抗體檢測(cè)方法，雖然敏感性和特異性落后于ELISA等免疫學(xué)檢測(cè)方法，但具有試驗(yàn)成本低廉，操作簡單，特別適合于基層應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)。本研究經(jīng)過前期反應(yīng)條件的不斷優(yōu)化，最后表明10倍濃縮的FadV-4滅活抗原作為檢測(cè)抗原時(shí)，其檢測(cè)結(jié)果易于觀察。

4.3 卵黃杭體提取方法的選擇

卵黃的主要成分為蛋白質(zhì)和脂類，其中以脂蛋白占大部分，而抗體為水溶性蛋白，卵黃抗體的提取就是將卵黃中抗體和其他成分分離，從而去除脂類成分，保留水溶性的卵黃抗體[4]。本研究選擇辛酸提取法對(duì)卵黃抗體進(jìn)行了提取，后期檢驗(yàn)表明提取后的卵黃抗體具有良好的抗體效價(jià)與預(yù)防治療效果，取得了理想的試驗(yàn)結(jié)果。

4.4 卵黃杭體檢驗(yàn)項(xiàng)目的選擇

由于目前國內(nèi)尚無商品化的雞安卡拉病卵黃抗體，也無雞安卡拉病卵黃抗體的制造與檢驗(yàn)操作規(guī)程，而卵黃抗體的檢驗(yàn)是卵黃抗體安全與有效的保障，對(duì)卵黃抗體的臨床應(yīng)用至關(guān)重要。本研究通過對(duì)制備的FadV-4（SD株）卵黃抗體進(jìn)行無菌檢驗(yàn)、物理性狀檢驗(yàn)、甲醛殘留量測(cè)定、辛酸殘留量測(cè)定、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)、安全性檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)等常規(guī)檢驗(yàn)，且檢驗(yàn)結(jié)果表明本研究制備的FadV-4（SD株）卵黃抗體能夠達(dá)到國家對(duì)禽類病毒病卵黃抗體同類產(chǎn)品質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)要求，為FadV-4（SD株）卵黃抗體的臨床推廣應(yīng)用提供了質(zhì)量保障。

4.5 卵黃杭體的應(yīng)用效果

本研究的臨床應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果表明卵黃抗體對(duì)FadV-4感染的預(yù)防保護(hù)率高達(dá)98.67%，對(duì)FadV-4感染的治療率高達(dá)97.33%，卵黃抗體對(duì)臨床中FadV-4的感染具有良好的預(yù)防與治療效果，可用于雞場(chǎng)雞安卡拉病的保健和治療。為我國雞安卡拉病的預(yù)防與治療提供了一種快速、簡單、安全、有效的技術(shù)手段，將具有很好的推廣和應(yīng)用前景，對(duì)于逐步降低我國雞安卡拉病的感染率、保障我國養(yǎng)禽業(yè)的健康與快速發(fā)展將具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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