三種不同腺病毒基因組提取方法對(duì)全基因組克隆構(gòu)建的影響分析

李瀟　周榮　馬強(qiáng)

[摘要] 目的 建立一種簡(jiǎn)單、快速、有效、純度高的人腺病毒全基因組提取的方法。 方法 用60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)A549或AD293細(xì)胞，接種培養(yǎng)人7型腺病毒（HAdV-7）CQ1198株，收集病毒感染的細(xì)胞，分別用Hirt's改良法、試劑盒A和試劑B提取HAdV-7-CQ1198病毒株全基因組，提取的基因組進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶酶切實(shí)驗(yàn)、細(xì)菌內(nèi)同源重組實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)染細(xì)胞拯救病毒實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果 幾種方法都成功獲得高質(zhì)量的腺病毒全基因組，可以用于PCR、測(cè)序、酶切、同源重組和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)；兩種試劑盒方法較傳統(tǒng)的Hirt's改良法更快，不需要特別步驟去除細(xì)胞基因組，可以在1 h內(nèi)完成基因組提取。其中，試劑盒A提取的病毒基因組量最多（20～50 μg），RNA含量最少，不需要另外加入核糖核酸酶（RNase），而Hirt's改良法需要在裂解液中或最終產(chǎn)物中加入RNase以去除細(xì)胞RNA成分。 結(jié)論 試劑盒A和試劑盒B均可替代傳統(tǒng)Hirt's提取方法用于快速提取高質(zhì)量腺病毒基因組，提取的基因組能用于酶切分型、轉(zhuǎn)染等實(shí)驗(yàn)操作。

[關(guān)鍵詞] 腺病毒；病毒核酸提取；酶切分析；病毒感染；Hirt's方法

[中圖分類(lèi)號(hào)] R373 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）12（c）-0004-04

[Abstract] Objective To construct a simple， fast， efficient， high purity method for adenovirus genome extraction. Methods A549 or AD293 cells were cultured in 60 mm culture dish， and infected with human adenovirus type 7 （HAdv-7） CQ1198 strain. The infected cells were collected to extract adenovirus genome by using improved Hirt's method， Extraction Kit A and Extraction Kit B. The extracted adenovirus genomes were detected by restriction endonuclease analysis， homologous recombination method， transfection and virus rescue experiment. Results High-quality adenovirus genomes were obtained by three different methods. The extracted DNA can be used for PCR， sequencing， restriction endonuclease analysis， homologous recombination and transfection experiment. The extraction process used two kinds of Kits were faster than improved Hirt's method， and all the Kit methods had no additional process to remove host cell's genome， the process can be finished in 1 hour. Compared all three kinds of methods， comprehensively， Extraction Kit A method obtained as most viral DNA as other methods （20-50 μg）， and it did not need RNase because the extracted product barely had RNA. Compare to the Kits， the improved Hirt's method needed RNase to remove cellular RNA in the lysate or in the final production. Conclusion Compare to the traditional Hirt's method， Extraction Kit A and Extraction Kit B can be used to extract high quality adenovirus genome， and the extracted product can also be used for enzyme-cutting type， transfection and other experimental operations.

[Key words] Adenovirus； Viral nucleic acid extraction； Restriction endonuclease analysis； Virus infection； Hirt's method

由于目前國(guó)內(nèi)外并沒(méi)有專(zhuān)門(mén)為腺病毒基因組提取設(shè)計(jì)的試劑盒，因此本研究首次嘗試應(yīng)用為PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的普通病毒核酸提取試劑盒提取腺病毒全基因組，并與傳統(tǒng)的Hirt's改良法進(jìn)行比較，以期建立一種簡(jiǎn)單、快速且純度高的人腺病毒全基因組提取方，具體報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

人7型腺病毒（HAdV-7）CQ1198毒株（Genebank號(hào)：JX625134.1）由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院分離培養(yǎng)并惠贈(zèng)。用60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)A549或AD293細(xì)胞，接種培養(yǎng)HAdV-7CQ1198毒株，感染2～3 d后吹打細(xì)胞收集到15 mL離心管，離心半徑6 cm，800 r/min離心5 min去除上清，收集病毒感染的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL Ep管中。

1.2 方法

分別用改進(jìn)的Hirt's方法、試劑盒A（High Pure Viral Nucleic Acid Kit，Roche，批號(hào)：10227300）和試劑B（Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0，Takara，批號(hào)：AK2101Y）提取HAdV-7CQ1198病毒株全基因組，提取的基因組進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶酶切實(shí)驗(yàn)、細(xì)菌內(nèi)同源重組實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)染細(xì)胞拯救病毒實(shí)驗(yàn)。

1.2.1 改良Hirt's法提取腺病毒基因組 按文獻(xiàn)報(bào)道的Hirt's改良法提取HAdV-7CQ1198感染的細(xì)胞中提取腺病毒基因組，主要步驟為收集的感染細(xì)胞劇烈震蕩分散，加入800 μL新鮮配制的裂解液（10 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，pH 7.5，1%SDS，100 μg/mL Proteinase K），37℃孵育1 h，往離心管中逐滴加入5 mol/L的NaCl溶液200 μL，混勻，冰浴1 h以上，離心半徑6 cm，14 000 r/min離心5 min取上清，加入1 μg RNaseA處理；依次用酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）和氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提，取上層水相，加入1/10體積的3 mol/L NaAc和2倍體積的無(wú)水乙醇置-20℃ 30 min，4℃，12 400 r/min離心5 min去上清，70%乙醇洗滌，室溫干燥后溶于50 μL TE溶液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試劑盒A提取腺病毒基因組 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒感染細(xì)胞內(nèi)的腺病毒基因組。

1.2.3 試劑盒B提取腺病毒基因組 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒感染細(xì)胞內(nèi)的腺病毒基因組。

1.2.4 DNA定量 用紫外分光光度計(jì)（NANODROP 2000c，Thermo Scientific）檢測(cè)基因組DNA濃度，同時(shí)記錄OD260/OD280比值；腺病毒熒光定量PCR（7500 Real Time PCR system，ABI）方法檢測(cè)腺病毒基因組拷貝數(shù)；為進(jìn)一步確定抽提的病毒基因組DNA純度，取2 μL基因組DNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5 DNA限制性酶切和凝膠電泳分析 提取的基因組DNA加入1 μL RNase于37℃孵育5 min，取4 μL，配制10 μL酶切體系，用Hind Ⅲ限制性?xún)?nèi)切酶（NEB）37℃酶切2 h，取5 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.6 病毒拯救 各取1 μg提取的病毒基因組，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（Lipofectamine TMLTX plus reagents，Invitrogen，批號(hào)：1581835）轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染8 d后收集細(xì)胞，凍融3次后轉(zhuǎn)接A549細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察各提取方法的耗時(shí)（min）、DNA量（μg）、OD260/OD280、基因組拷貝數(shù)；3種方法提取的病毒基因組用HindⅢ限制性?xún)?nèi)切酶酶切后行電泳，觀察電泳條帶；分析病毒拯救和病毒全基因組克隆構(gòu)建。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腺病毒基因組提取的3種方法比較

3種方法都可以從細(xì)胞中有效提取腺病毒基因組，與Hirt's改良法相比，試劑盒A法和試劑盒B法只需要30 min左右，提取時(shí)間顯著縮短，提取的DNA含量顯著增多，基因組拷貝數(shù)更大，其中，試劑盒A法提取的DNA含量最多以及基因組拷貝數(shù)最大；3種方法各項(xiàng)目比較，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 DNA限制性酶切分析

3種方法提取的病毒基因組用HindⅢ限制性?xún)?nèi)切酶酶切后電泳條帶都很清晰，背景干凈，無(wú)降解，與理論酶切圖譜相符。見(jiàn)圖1。

2.3 病毒拯救和病毒全基因組克隆構(gòu)建分析

3種方法提取的病毒基因組轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞后都能成功拯救出病毒，其中試劑盒A和試劑盒B的病毒拯救效率相似，高于Hirt's法（圖2、表2）。三種提取方法拯救的病毒，其感染A549細(xì)胞的生物學(xué)特性無(wú)差別（圖3）。3種方法提取的病毒基因組與穿梭載體在BJ5183感受態(tài)細(xì)菌內(nèi)同源重組，全基因組克隆構(gòu)建的成功次數(shù)中試劑盒法最多，與Hirt's改良法相比，提取DNA重組后菌落數(shù)試劑盒A法約3800個(gè)，試劑盒B法約9000個(gè)，菌落數(shù)顯著提高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表2。

3 討論

人腺病毒（human adenovirus，HAdV）分為7組共52個(gè)血清型、68種基因型，其中1/3的腺病毒能引起成人和嬰幼兒呼吸道、胃腸道、眼部等多種感染性疾病，甚至引起心肌炎、腦膜腦炎[1-4]。病毒全基因組限制性酶切分析（restrictionendonucleaseanalysis，REA）是一種簡(jiǎn)單而且花費(fèi)少的腺病毒基因型鑒別的方法，廣泛用于腺病毒流行病學(xué)調(diào)查研究及基因工程腺病毒的分型鑒定中。REA實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行需要提取高質(zhì)量的腺病毒全基因組，目前國(guó)際上通行的腺病毒基因組提取方法是改良的Hirt's法，該方法雖然避免了大量培養(yǎng)細(xì)胞的過(guò)程，但依然耗時(shí)耗力。

從感染的細(xì)胞中提取病毒基因組的標(biāo)準(zhǔn)方法通常要求培養(yǎng)多達(dá)幾十個(gè)T75瓶的病毒，不僅耗時(shí)長(zhǎng)，且過(guò)程復(fù)雜[5-7]。Hirt's法則直接從培養(yǎng)的腺病毒感染細(xì)胞中抽提病毒基因組，不需要純化病毒；改良的Hirt's方法冰浴孵育沉淀細(xì)胞基因組的時(shí)間可縮短至1 h。目前大部分商品化試劑盒是用離心柱吸附病毒基因組，優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便，不需要使用有機(jī)試劑酚/氯仿抽提；缺點(diǎn)是只能用于非細(xì)胞樣品，這是因?yàn)槭羌?xì)胞樣品中大量的宿主基因組不易去除[8-11]，相關(guān)科研人員不得不使用Hirt's法或改良Hirt's法。目前市售的可直接從細(xì)胞樣品中提取病毒基因組的商品化的試劑盒較少，提取的病毒基因組一般用于PCR或RT-PCR，對(duì)于其他用途鮮有報(bào)道[12-14]。本研究購(gòu)買(mǎi)了來(lái)源于兩間不同制造商的試劑盒，進(jìn)行腺病毒基因組提取實(shí)驗(yàn)，以期替代傳統(tǒng)Hirt's提取方法[15-21]。

本研究首次用這兩種試劑盒提取HAdV-7基因組，結(jié)果表明兩種試劑盒均可以快速、簡(jiǎn)便、有效的從腺病毒感染細(xì)胞中提取病毒基因組，整個(gè)過(guò)程僅需30 min左右，沒(méi)有使用有機(jī)試劑酚/氯仿，而且提取的病毒DNA量更多，從60 mm培養(yǎng)皿中可以提取多達(dá)15～35 μg的病毒基因組DNA，是Hirt's方法提取量的3～7倍。這兩種試劑盒也可用于從細(xì)胞樣品中提取其他種類(lèi)的病毒全基因組，如皰疹病毒全基因組等。本研究用兩種試劑盒方法提取的腺病毒DNA完整性好，可以用于限制性?xún)?nèi)切酶酶切實(shí)驗(yàn)，從60 mm培養(yǎng)皿中提取的病毒DNA可以進(jìn)行多達(dá)35次酶切反應(yīng)（1 μg/次），而Hirt's法可能只能進(jìn)行5次左右的酶切反應(yīng)。兩種試劑盒方法和Hirt's法提取的腺病毒基因組都可以用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)和細(xì)菌內(nèi)同源重組實(shí)驗(yàn)，但試劑盒方法所獲得的菌落數(shù)更多。

綜上所述，使用市售可用于細(xì)胞樣本的病毒基因組提取試劑盒所獲得腺病毒基因組，不但可用于后續(xù)的PCR實(shí)驗(yàn)，還可用于全基因組限制性酶切分析、病毒全基因組克隆構(gòu)建以及病毒拯救，并且試劑盒方法簡(jiǎn)單、快速、得率高，可替代傳統(tǒng)Hirt's提取法和改良Hirt's提取法。

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（收稿日期：2016-09-21 本文編輯：程 銘）