藏藥鐵棒錘及其習(xí)用品中3種生物堿含量測(cè)定

趙梅宇 宋良科 任瑤瑤 譚睿

摘要：目的 建立同時(shí)測(cè)定鐵棒錘及其習(xí)用品中苯甲酰烏頭堿、烏頭堿、3-脫氧烏頭堿的HPLC含量測(cè)定方法，為鐵棒錘藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)毒性成分控制及其與習(xí)用品區(qū)別提供依據(jù)。方法 采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.04%三乙胺（每1000 mL水加4 mL三乙胺、1.68 mL磷酸），梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫25 ℃。結(jié)果 苯甲酰烏頭堿、烏頭堿、3-脫氧烏頭堿分離度良好，3種成分在檢測(cè)范圍內(nèi)均呈良好線性（r>0.999），平均加樣回收率為97.66%～98.47%，RSD為0.84%～1.60%。結(jié)論 鐵棒錘及其習(xí)用品中3種生物堿的含量差異較大，多裂烏頭A. polyschistum、縮梗烏頭A. sessiliflorum應(yīng)另立藥名加以區(qū)別。

關(guān)鍵詞：鐵棒錘；多裂烏頭；縮梗烏頭；生物堿；含量測(cè)定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.020

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）07-0083-04

Abstract： Objective To establish a method for determining benzoylaconine， aconitine and 3-deoxyaconitine in Aconitum pendulum and the habitually medicinal materials by HPLC； To provide basis for control of quality standard toxicity composition in Aconitum pendulum and difference between Aconitum pendulum and the habitually medicinal materials. Methods Agilent Eclipse XDB-C18 column （250 mm × 4.6 mm，5 μm） was used at 25 ℃ with the mobile phase consisting of acetonitrile-0.04% trimethylamine （each 1000 mL of water plus 4 mL triethylamine and 1.68 mL phosphoric acid） by gradient elution； detection wavelength was 235 nm； the flow rate was 1 mL/min； injection volume was 10 μL. Results The benzoylaconine， aconitine and 3-deoxyaconitine had good separation and linear relationship in the corresponding range （r>0.999）. The average recovery rates were 97.66%–98.47%， and RSD were 0.84%–1.60%. Conclusion The contents of 3 alkaloid were different in Aconitum pendulum and the habitually medicinal materials. Both A. polyschistum and A. sessiliflorum need separate drug names.

Keywords： Aconitum pendulum； A. polyschistum； A. sessiliflorum； alkaloid； content determination

榜那（Radix Aconiti）始載于藏醫(yī)學(xué)巨著《四部醫(yī)典》[1]，其味甘、微苦，性熱，有大毒，具有驅(qū)寒止痛、祛風(fēng)定驚功效，用于治療龍病、寒病、黃水病、麻風(fēng)、癲狂等。1987年版《四川中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[2]收載藥材雪上一支蒿，別名鐵棒錘、鐵棒七、三轉(zhuǎn)半：為毛茛科烏頭屬植物鐵棒錘Aconitum pendulum、伏毛鐵棒錘A. flavum、多裂烏頭A. polyschistum的干燥根。

1995年版《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥》（第一冊(cè)）[3]收載藥材鐵棒錘，藏藥名為榜那，為毛茛科植物鐵棒錘A. pendulum、伏毛鐵棒錘A. flavum的干燥根。1997年，《中華藏本草》[4]收載藏藥材曼欽-鐵棒錘，為毛茛科烏頭屬植物鐵棒錘A. pendulum、伏毛鐵棒錘A. flavum及多裂烏頭A. polyschistum等多種同屬植物的干燥根。2010年版《四川中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[5]因《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥》已收載鐵棒錘，不再收載藥材雪上一支蒿（鐵棒錘）。因多裂烏頭A. polyschistum和縮梗烏頭A. sessiliflorum在四川阿壩等藏區(qū)已長(zhǎng)期作鐵棒錘藥用，而多裂烏頭藥用效果好，一直受到青睞。近10多年來(lái)，四川阿壩洲馬爾康、若爾蓋等縣大量引種栽培多裂烏頭A. polyschistum，并作鐵棒錘銷售。根據(jù)鐵棒錘藥效成分（也是毒性成分）主要為烏頭堿、3-脫氧烏頭堿、3-乙酰烏頭堿、苯甲酰烏頭堿等[6-7]的特點(diǎn)，本研究建立HPLC分析方法，對(duì)比鐵棒錘及其習(xí)用品中生物堿的種類和含量，為鐵棒錘質(zhì)量控制和其習(xí)用品多裂烏頭、縮梗烏頭的資源合理利用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1260-II型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司），BS-110S型電子分析天平（北京賽多利斯電子天平有限公司），KQ-500DE型數(shù)控超聲波清潔器（昆山市超聲儀器有限公司）。

苯甲酰烏頭堿、烏頭堿、3-脫氧烏頭堿（成都普思生物生物科技有限公司，批號(hào)分別為PS010300、PS0150-0025、PS13031302，含量≥98%），甲醇、乙腈為色譜純（Sigma），其他試劑均為分析純。

藥材樣品經(jīng)西南交通大學(xué)宋良科教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物鐵棒錘（編號(hào)1～6），多裂烏頭（編號(hào)7～9）、縮梗烏頭（編號(hào)10、11），見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.04%三乙胺（每1000 mL水加4 mL三乙胺、1.68 mL磷酸），梯度洗脫（0～15 min，25%～30%乙腈；15～25 min，30%～40%乙腈；25～45 min，40%～60%乙腈），檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫25 ℃。在上述色譜條件下，供試品中苯甲酰烏頭堿、烏頭堿、3-脫氧烏頭堿色譜峰保留時(shí)間與對(duì)照品一致，3個(gè)成分的色譜峰能達(dá)到較好分離，樣品其他成分對(duì)待測(cè)成分的測(cè)定無(wú)干擾。各成分吸收峰理論塔板數(shù)均不低于4000，色譜峰分離度均大于1.5。色譜圖見圖1。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取苯甲酰烏頭堿3.03 mg、烏頭堿12.17 mg、3-脫氧烏頭堿3.89 mg，分別置于10 mL容量瓶中，分別加甲醇溶解并定容，搖勻。依次分別精密吸取上述對(duì)照品溶液各1 mL于同一5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL分別含苯甲酰烏頭堿0.060 6 mg、烏頭堿0.243 4 mg、3-脫氧烏頭堿0.077 8 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取鐵棒錘粉末（過(guò)2號(hào)篩）約2 g，精密稱定，置錐形瓶中，加3 mL氨水，精密加入50 mL乙酸乙酯-異丙醇（1∶1），稱定質(zhì)量，超聲處理（300 W，40 kHz，25 ℃以下）30 min，放冷，用乙酸乙酯-異丙醇（1∶1）混合溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液25 mL，40 ℃以下減壓回收溶劑至干，殘?jiān)芗尤爰状? mL，溶解，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對(duì)照品溶液2、5、10、15、20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量（mg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明3種生物堿在相應(yīng)范圍內(nèi)關(guān)系良好，見表2。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果苯甲酰烏頭堿、烏頭堿、3-脫氧烏頭堿峰面積的RSD分別為1.94%、2.32%、1.67%，表明儀器精密度較好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取鐵棒錘樣品約2 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于制備后0、3、6、9、18、24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果苯甲酰烏頭堿、烏頭堿、3-脫氧烏頭堿峰面積的RSD分別為2.15%、2.07%、1.51%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定可用。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取1號(hào)鐵棒錘樣品6份，每份約2 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果苯甲酰烏頭堿、烏頭堿、3-脫氧烏頭堿峰面積的RSD分別為1.27%、1.34%、2.67%，表明本試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱定1號(hào)鐵棒錘樣品6份，每份約0.8 g，分別精密加入1 mL對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果苯甲酰烏頭堿、烏頭堿、3-脫氧烏頭堿的平均回收率分別為97.66%、98.41%、98.47%，RSD分別為1.60%、1.29%、0.84%，見表3～表5。

2.9 樣品含量測(cè)定

精密稱取各藥材粉末，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各樣品中3種成分含量，每個(gè)樣品平行試驗(yàn)3份，結(jié)果見表6。

3 討論

本研究在文獻(xiàn)[8-10]對(duì)比及本課題組前期研究基礎(chǔ)上，將流動(dòng)相優(yōu)化為乙腈-0.04%三乙胺（每1000 mL水加4 mL三乙胺、1.68 mL磷酸）進(jìn)行梯度洗脫，使各成分達(dá)到理想的分離，可同時(shí)測(cè)定鐵棒錘中苯甲酰烏頭堿、烏頭堿、3-脫氧烏頭堿的含量，具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好的特點(diǎn)。該方法為鐵棒錘指紋圖譜的建立和藥材質(zhì)量控制奠定了良好基礎(chǔ)。

苯甲酰烏頭堿、烏頭堿、3-脫氧烏頭堿為鐵棒錘Aconitum pendulum、伏毛鐵棒錘A. flavum及其習(xí)用品多裂烏頭A. polyschistum、縮梗烏頭A. sessiliflorum的共有成分。本研究結(jié)果表明，多裂烏頭的烏頭堿平均含量為鐵棒錘的1.4倍，而3-脫氧烏頭堿的平均含量為鐵棒錘的2.6倍，僅苯甲酰烏頭堿的含量低于鐵棒錘。苯甲酰型生物堿毒性為雙酯型烏頭堿的1/1500～1/150[11]，可見多裂烏頭毒性（藥用成分）遠(yuǎn)高于鐵棒錘，又因多裂烏頭A. polyschistum在四川阿壩藏區(qū)藥用歷史悠久，并取名三轉(zhuǎn)半（藥材在碗底研磨以此限量）是有藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為依據(jù)的，應(yīng)另立藥物名稱為鐵棒七或三轉(zhuǎn)半，收入藥材標(biāo)準(zhǔn)，解決資源利用問題。

縮梗烏頭的烏頭堿平均含量?jī)H為鐵棒錘的0.28倍，且3-脫氧烏頭堿的含量不及鐵棒錘的1/3，僅苯甲酰烏頭堿的含量約為鐵棒錘的1.4倍，由于單酯型烏頭堿毒性遠(yuǎn)低于雙酯型烏頭堿，故縮梗烏頭的毒性遠(yuǎn)低于鐵棒錘，不宜作鐵棒錘或雪上一枝蒿藥用。

本研究前期對(duì)鐵棒錘的名稱與基源考證認(rèn)為：榜那-鐵棒錘藥材（雪上一枝蒿）涉及毛茛科烏頭屬16種基源植物的塊根；在藏、漢居住地或漢、藏混居區(qū)均有分布的鐵棒錘A. pendulum、伏毛鐵棒錘A. flavum、多裂烏頭A. polyschistum為藥用主流品種。目前各級(jí)藥材標(biāo)準(zhǔn)均未收載多裂烏頭A. polyschistum而使其淪為鐵棒錘和雪上一枝蒿的偽品；藥農(nóng)不能出售，藥廠不能購(gòu)買。本研究結(jié)果表明，鐵棒錘、多裂烏頭、縮梗烏頭主要藥效成分種類基本一致，多裂烏頭的雙酯型烏頭堿成分含量比鐵棒錘高，毒性更大，但驅(qū)寒止痛、祛風(fēng)定驚效果更好，不應(yīng)廢棄，而應(yīng)另立藥物名稱收入標(biāo)準(zhǔn)?？s梗烏頭A. sessiliflorum又名雪上一支蒿，各級(jí)藥材標(biāo)準(zhǔn)也未收載，其單酯型烏頭堿比鐵棒錘含量高，雙酯型烏頭堿含量更低，安全性比鐵棒錘高，可進(jìn)一步研究，作口服藥材使用。

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