吉林省不同產(chǎn)地萬年蒿中東莨菪內(nèi)酯HPLC含量測(cè)定

徐 犇，李 納，劉吉爽，張雅蓉，徐文慧，陳 新，邱智東

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117）

萬年蒿為菊科植物白蓮蒿（Artemisia sacrorum Ledeb.）的干燥地上部分，全草入藥。除高寒地區(qū)外，幾乎遍布全中國，各地均有分布，資源分布廣泛[1]，尤其吉林省長(zhǎng)白山區(qū)域蘊(yùn)藏量豐富。味苦，辛，性平，入肝，腎經(jīng)，具有清熱解毒，涼血止血之功效。《新編本草綱目》言其“全草：味苦，性寒。有清濕熱、利尿、止血的功能。用于黃疸，流感?！泵耖g入藥，有清熱、解毒、祛風(fēng)、利濕之效，用于治療急慢性肝炎、小兒驚風(fēng)、發(fā)燒、闌尾炎、急慢性胃腸炎、婦女內(nèi)寒證等，可作“茵陳”代用品[2]，又作止血藥。牧區(qū)作牲畜的飼料[3]。萬年蒿中含有多種化學(xué)成分，如黃酮類、肉桂酸類、香豆素類、萜類、多糖、揮發(fā)油等成分[4-9]。本文采用HPLC進(jìn)行了萬年蒿中東莨菪內(nèi)酯的含量測(cè)定方法研究，選取東莨菪內(nèi)酯（C10H8O4）為萬年蒿含量測(cè)定指標(biāo)。東莨菪內(nèi)酯具有抗炎、抗菌[10]等作用，是萬年蒿中的重要活性成分[11-13]。不同產(chǎn)地萬年蒿中東莨菪內(nèi)酯的含量存在較大的差異。本研究建立HPLC 測(cè)定萬年蒿中東莨菪內(nèi)酯含量的方法，操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，分析快速準(zhǔn)確，可為萬年蒿的質(zhì)量評(píng)價(jià)及資源開發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1260型HPLC儀（美國Agilent公司）；TU-1901型紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；FA1204B電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ-250DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HWS12型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SHZ- Ⅲ型循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；萬能高速粉碎機(jī)（浙江紅景天工貿(mào)有限公司）。

東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)：110768-200504）由中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：WondaSil C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流 動(dòng) 相：A為 甲 醇，B為0.3%磷酸溶液，梯度洗脫條件：0～40 min（24%A→24% A），40～41 min（24% A→75% A），41～70 min（75% A→75% A）；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：344 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含15 μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備方法的選擇

2.3.1 不同提取溶劑的考察 取同一批藥材粉末（過二號(hào)篩）6份，取1 g，精密稱定，置錐形瓶中，分別精密加入乙醇、70%乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。注入液相色譜儀，結(jié)果顯示甲醇溶液作溶劑提取含量最高為0.071%，所以選擇甲醇溶液作為提取溶劑。

2.3.2 不同提取方法的考察 以甲醇為提取溶劑，分別采用超聲提取1 h和加熱回流提取1 h提取，結(jié)果超聲法提取東莨菪內(nèi)酯含量為0.067%，加熱回流法提取東莨菪內(nèi)酯含量為0.071%。結(jié)果表明，加熱回流提取效率較高，所以選擇加熱回流為提取方式。

2.3.3 提取溶劑體積考察 以甲醇為提取溶劑，對(duì)提取溶劑體積25、50、100 mL分別進(jìn)行考察，測(cè)定東莨菪內(nèi)酯含量結(jié)果依次為0.063%、0.070%、0.071%。結(jié)果表明，提取溶劑25 mL的提取率比50 mL的提取率低，而50 mL與100 mL無顯著性差異，且考慮成本，所以確定提取溶劑量為50 mL。

2.3.4 提取時(shí)間的考察 以甲醇為提取溶劑，對(duì)回流時(shí)間30、60、120 min進(jìn)行了比較，測(cè)定東莨菪內(nèi)酯含量結(jié)果依次為0.067%、0.071%、0.071%。結(jié)果表明，提取時(shí)間為60 min與120 min提取率相當(dāng)，所以確定提取時(shí)間為60 min。

2.3.5 供試品溶液制備的確定 根據(jù)以上考察結(jié)果，確定供試品溶液的制備方法為取本品粉末（過二號(hào)篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系和范圍 精密稱取東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品適量，加甲醇溶液溶制成每1 mL含東莨菪內(nèi)酯75 μg的溶液，即得。分別精密吸取上述東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、5.0、8.0、10.0、12.0 mL 于 25 mL量瓶中，用甲醇定容，即得。按2.1項(xiàng)下的色譜條件精密吸取上述對(duì)照品溶液10 μL，分別注入液相色譜儀，依法測(cè)定，以對(duì)照品的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：Y = 39.179 X -3.532 7，相關(guān)系數(shù)r = 0.999 9，結(jié)果表明，東莨菪內(nèi)酯在3.016～36.192 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 專屬性試驗(yàn) 為進(jìn)一步考察試驗(yàn)的合理性，按照供試品溶液制法制得不含樣品的陰性對(duì)照溶液，依法測(cè)定，結(jié)果陰性對(duì)照液在與對(duì)照品峰相應(yīng)的保留時(shí)間處無干擾峰出現(xiàn)，表明本方法具有良好的專屬性。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液10 μL，分別于0、2、6、12、18、24 h精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算東莨菪內(nèi)酯含量，結(jié)果顯示東莨菪內(nèi)酯峰面積的RSD為0.79%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。2.4.4 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，記錄峰面積，計(jì)算東莨菪內(nèi)酯含量，結(jié)果顯示東莨菪內(nèi)酯峰面積的RSD為0.90%。表明本方法所用儀器精密度良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批萬年蒿藥材6份，按2.3.5項(xiàng)下方法平行制備，獨(dú)立測(cè)定6份，測(cè)得東莨菪內(nèi)酯含量，結(jié)果顯示東莨菪內(nèi)酯的含量的RSD為1.80%。表明本方法的重復(fù)性良好。見表1。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n = 6） %

2.4.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取同法測(cè)定已知含量的萬年蒿藥材6份，每份約1 g，精密稱定，分別精密加入適量東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品溶液，按2.3.5項(xiàng)下方法平行制備， 按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)定東莨菪內(nèi)酯的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為105.53 %，RSD 值為 1.54 %。2.4.7 耐用性試驗(yàn)

2.4.7.1 不同廠家色譜柱的考察 取樣品溶液分別在三根不同廠家的C18色譜柱，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果色譜柱WondaSil C18、色譜柱Agilent TC-C18與色譜柱ZORBAX Eclipse XDB-C18分離效果均良好，三根色譜柱的理論塔板數(shù)按東莨菪內(nèi)酯含量計(jì)算＞3 000，表明該方法穩(wěn)定可行。

2.4.7.2 不同柱溫的考察 取樣品溶液分別在柱溫30、35、38 ℃，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果柱溫為33、35、38 ℃ 條件下，東莨菪內(nèi)酯均可以分離完全，并且理論塔板數(shù)按東莨菪內(nèi)酯計(jì)算均＞3 000，測(cè)定結(jié)果較為穩(wěn)定，該方法可行。

2.4.7.3 不同流速的考察 取樣品溶液分別在流速0.8、0.9、1.0 mL/min，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果在不同流速下，東莨菪內(nèi)酯的分離效果均良好，理論塔板數(shù)按東莨菪內(nèi)酯計(jì)算均＞3 000，測(cè)定結(jié)果較為穩(wěn)定，該方法可行。

2.5 樣品含量測(cè)定 取 13 批吉林省不同產(chǎn)地的萬年蒿藥材各適量，按2.3.5項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按上述方法和色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算東莨菪內(nèi)酯的含量。結(jié)果見表2。

表2 吉林省不同產(chǎn)地萬年蒿中東莨菪內(nèi)酯的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)選擇 分別取東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品溶液和供試品溶液，以甲醇為空白溶液校正，應(yīng)用紫外-可見分光光度法，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，均在344 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，并且《中華人民共和國藥典》各藥材項(xiàng)下高效液相色譜法測(cè)定東莨菪內(nèi)酯含量測(cè)定波長(zhǎng)均為344 nm，故確定東莨菪內(nèi)酯檢測(cè)波長(zhǎng)為344 nm。

3.2 流動(dòng)相色譜條件考察 在對(duì)流動(dòng)相色譜條件進(jìn)行考察時(shí)，參考《中華人民共和國藥典》華山參藥材中東莨菪內(nèi)酯的含量測(cè)定項(xiàng)，選擇甲醇- 0.3%磷酸溶液為流動(dòng)相，經(jīng)試驗(yàn)調(diào)整多種不同流動(dòng)相的比例，考察色譜圖分離情況，結(jié)果供試品整個(gè)色圖譜中出現(xiàn)密集的雜峰，連續(xù)不斷，即使延長(zhǎng)一次分析時(shí)間300 min，雜峰仍然連續(xù)不斷出現(xiàn)。為節(jié)省分析時(shí)間，經(jīng)調(diào)整比較多種比例的梯度系統(tǒng)，綜合考慮色譜分離效果、主要色譜峰的特征和重現(xiàn)性，最終選取了文中的流動(dòng)相梯度系統(tǒng)。

3.3 供試品溶液的制備方法研究 在試驗(yàn)中，比較了乙醇、70%乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇和 30%甲醇 6 種不同的提取溶劑，考察了不同提取溶劑加入量，對(duì)比了回流提取、超聲提取2 種不同的提取方法，考察了不同提取時(shí)間對(duì)其含量測(cè)定的影響，最終選取甲醇為提取溶劑，提取方法選擇加熱回流提取方法，提取溶劑量為50 mL，提取時(shí)間為1 h，確定了供試品溶液的制備方法。

3.4 分析方法的驗(yàn)證研究 按《中華人民共和國藥典》有關(guān)規(guī)定，進(jìn)行了一系列方法學(xué)考察包括線性范圍、專屬性、穩(wěn)定度、精密度、準(zhǔn)確度和耐用性等，結(jié)果表明，本文所建立萬年蒿中東莨菪內(nèi)酯的含量測(cè)定方法靈敏，精密度高，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，具有很好的耐用性，可作為該品種的質(zhì)量控制方法，并可為今后萬年蒿藥材及其制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

3.5 樣品含量測(cè)定結(jié)果分析 本研究共收集了13 批吉林省不同產(chǎn)地的萬年蒿藥材，研究結(jié)果顯示，吉林省不同產(chǎn)地萬年蒿中東莨菪內(nèi)酯的含量存在較大差異，含量范圍為0.026%～0.117%?？赡芘c產(chǎn)地的自然環(huán)境、氣候等有較大的相關(guān)性。除此之外，東莨菪內(nèi)酯的含量可能還與萬年蒿藥材采集時(shí)間有關(guān)。通過對(duì)比，8月份采集的萬年蒿中東莨菪內(nèi)酯的含量明顯高于9月份。為確定東莨菪內(nèi)酯含量與萬年蒿藥材采集時(shí)間是否存在相關(guān)性，還需進(jìn)一步研究。