HPLC法同時(shí)測(cè)定平臟調(diào)神顆粒中8種成分的含量

程中琴　劉小妹　施崇精　王姍姍　袁強(qiáng)華　宋英

中圖分類號(hào) R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）01-0033-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.01.09

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定平臟調(diào)神顆粒中鹽酸小檗堿、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芍藥苷、芒果苷、丹酚酸B和葛根素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為IntertSustain C18，流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（pH為3，梯度洗脫），流速為 1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm（0～23 min，葛根素、芒果苷）、230 nm（>23～30 min，芍藥苷）、220 nm（>30～50 min，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷）、286 nm（>50～60 min，丹酚酸B）、265 nm（>60～75 min，鹽酸小檗堿）、220 nm（>75～90 min，淫羊藿苷），柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：鹽酸小檗堿、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芍藥苷、芒果苷、丹酚酸B和葛根素檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為4.000～400.0、4.843～484.3、0.498～49.8、2.366～236.6、23.26～ 2 326.0、3.067～306.7、3.629～362.9、48.23～4 823.2 μg/mL（r≥0.999 4）；檢測(cè)限分別為0.02、0.02、0.02、0.02、0.01、0.02、0.01、0.01 μg/mL，定量限分別為0.07、0.05、0.06、0.05、0.03、0.07、0.02、0.03 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性（24 h）、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均<2.0%（n=6）；加樣回收率為 95.77%～103.50%，RSD為0.77%～2.22%（n=6）。結(jié)論：建立的方法可用于平臟調(diào)神顆粒中鹽酸小檗堿等8種成分含量的同時(shí)測(cè)定。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法；平臟調(diào)神顆粒；鹽酸小檗堿；淫羊藿苷；毛蕊花糖苷；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；芍藥苷；芒果苷；丹酚酸B；葛根素；含量測(cè)定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of berberine hydrochloride， icariin， acteoside， isoflavone glucoside， paeoniflorin， mangiferin， salvianolic acid B and puerarin in Pingzang tiaoshen granule. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on InertSustain C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.05mol/L potassium dihydrogen phosphate solution （pH to 3， gradient elution） with the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 250 nm （0-23 min， puerarin， mangiferin）， 230 nm （>23-30 min， paeoniflorin）， 220 nm （>30-50 min， isoflavone glucoside， acteoside）， 286 nm （>50-60 min， salvianolic acid B）， 265 nm （>60-75 min， berberine hydrochloride）， 220 nm （>75-90 min， icariin）. The column temperature was set at 30 ℃， and sample size was 10 μL. RESLUTS： The linear range of berberine hydrochloride， icariin， acteoside， isoflavone glucoside， paeoniflorin， mangiferin， salvianolic acid B and puerarin were 4.000-400.0， 4.843-484.3， 0.498-49.8， 2.366-236.6， 23.26-2 326.0， 3.067-306.7， 3.629-362.9 μg/mL， 48.23-4 823.2 μg/mL（r≥0.999 4）， respectively. The limits of detection were 0.02， 0.02， 0.02， 0.02， 0.01， 0.02， 0.01， 0.01 μg/mL； the limits of quantitation were 0.07， 0.05， 0.06， 0.05， 0.03， 0.07， 0.02， 0.03 μg/mL， respectively. RSDs of precision， stability （24 h） and repetition tests were all<2.0% （n=6）. The average recoveries were 95.77%-103.50% （RSD=0.77%-2.22%， n=6）. CONCLUSIONS： Established method can be used for simultaneous determination of 8 components such as berberine hydrochloride in Pingzang tiaoshen granule.

KEYWORDS HPLC； Pingzang tiaoshen granule； Berberine hydrochloride； Icariin； Acteoside； Isoflavone glucoside； Paeoni- florin； Mangiferin； Salvianolic acid B； Puerarin； Content determination

平臟調(diào)神顆粒系成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)方制成的顆粒劑，由黃連、生地黃、葛根、淫羊藿、黃芪、知母、赤芍、丹參、五味子、地骨皮、牡蠣等藥材組成，具有滋腎疏肝寧心、理氣解郁活血、生津斂汗安神、益氣清熱補(bǔ)虛的功效，主治自主神經(jīng)功能紊亂[1-2]。該制劑有效成分以黃連為君藥，故目前只以黃連中鹽酸小檗堿的含量為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)[1-2]，但相關(guān)藥效研究表明，除黃連中的鹽酸小檗堿有降糖作用，可用于治療糖尿病的并發(fā)癥外[3]，該制劑中的其他藥物亦有治療作用。淫羊藿中的淫羊藿苷可改善心血管系統(tǒng)功能，調(diào)節(jié)心臟供血供氧平衡[4]；生地黃中的毛蕊花糖苷和黃芪中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷均具有神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用[5-6]；赤芍中的芍藥苷可保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[7]；知母中的芒果苷具有抗炎作用[8]；丹參中的丹酚酸B有抗菌作用[9]；葛根中的葛根素具有抗炎、降血糖等藥理作用[10]。鑒于此，本課題組采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時(shí)測(cè)定平臟調(diào)神顆粒中鹽酸小檗堿、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芍藥苷、芒果苷、丹酚酸B和葛根素成分含量的方法，以期為完善該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括四元泵、二極管陣列檢測(cè)器、在線脫氣裝置、自動(dòng)進(jìn)樣器、Openl AB工作站（美國(guó)Agilent公司）；BP211D型電子分析天平（瑞士 Mettler-Toledo 公司）；AS20500BD 型超聲清潔儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；CXP-500A 型高速多功能粉碎機(jī)（上海市晟喜制藥機(jī)械有限公司）；Milli-Q Advantage A10型超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

平臟調(diào)神顆粒（成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院自制，批號(hào)：20170507、20170515、20170519；規(guī)格：10 g/袋，鹽酸小檗堿含量：≥1.5%）；鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：110713- 201212）、淫羊藿苷對(duì)照品（批號(hào)：110737-200415）、毛蕊花糖苷對(duì)照品（批號(hào)：111530-201411）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)：111920-201304）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201438）、芒果苷對(duì)照品（批號(hào)：111607- 200402）、丹酚酸B對(duì)照品（批號(hào)：111562-20131）、葛根素對(duì)照品（批號(hào)：110736-201438）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均>86%；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：IntertSustain C18（250 mm×4.6 mm ，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（磷酸調(diào)節(jié)至pH為3，B），梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm（0～23 min，葛根素、芒果苷）、230 nm（>23～30 min，芍藥苷）、220 nm（>30～50 min，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷）、286 nm（>50～60 min，丹酚酸B）、265 nm（>60～75 min，鹽酸小檗堿）、220 nm（>75～90 min，淫羊藿苷）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

梯度洗脫程序見表1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 毛蕊花糖苷對(duì)照品貯備液 精密稱取毛蕊花糖苷對(duì)照品2.5 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得毛蕊花糖苷對(duì)照品貯備液。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液 分別精密取鹽酸小檗堿、淫羊藿苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芍藥苷、芒果苷、丹酚酸B和葛根素對(duì)照品2.00、2.42、1.18、11.63、1.53、1.18、24.11 mg，以及“2.2.1”項(xiàng)下毛蕊花糖苷對(duì)照品貯備液1 mL，置于同一5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液 取樣品粉末1.0 g，置于25 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲（功率：250 W，頻率：50 kHz，下同）處理50 min，冷卻至室溫，加甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液 按樣品的制備工藝和配方比例，分別制備缺黃連、缺淫羊藿、缺知母、缺赤芍、缺丹參、缺生地黃、缺黃芪、缺葛根的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果，在該色譜條件下，各待測(cè)成分間，與各雜質(zhì)峰間均能達(dá)到基線分離，分離度>1.5，其他成分對(duì)待測(cè)成分的測(cè)定無干擾，理論板數(shù)以鹽酸小檗堿峰計(jì)為5 000，詳見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5 mL，分別置于5、10、20、25、50 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成系列混合對(duì)照品溶液。精密量取上述系列混合對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，線性關(guān)系考察結(jié)果見表2。

2.5 檢測(cè)限與定量限考察

取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí)，得檢測(cè)限；當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時(shí)，得定量限。結(jié)果，鹽酸小檗堿、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芍藥苷、芒果苷、丹酚酸B和葛根素的檢測(cè)限分別為0.02、0.02、0.02、0.02、0.01、0.02、0.01、0.01 μg/mL，定量限分別為0.07、0.05、0.06、0.05、0.03、0.07、0.02、0.03 μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定 6次，記錄峰面積。結(jié)果，鹽酸小檗堿、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芍藥苷、芒果苷、丹酚酸B和葛根素峰面積的RSD分別為0.92%、1.35%、1.09%、0.39%、0.47%、0.86%、0.70%、1.02%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20170507）適量，分別于室溫下放置 0、3、6、12、18、24 h 時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，鹽酸小檗堿、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芍藥苷、芒果苷、丹酚酸B和葛根素峰面積的RSD分別為 0.79%、1.60%、1.09%、1.52%、1.34%、0.79%、0.53%、1.07%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批（批號(hào)：20170507）樣品適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，鹽酸小檗堿、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芍藥苷、芒果苷、丹酚酸B和葛根素含量的平均值分別為19.64、26.76、1.98、3.00、26.81、1.76、5.59、48.54 mg/g，RSD分別為 0.82% 、1.73% 、0.69%、0.85%、0.74%、1.09%、0.25%、0.84%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品（批號(hào)：20170507）0.3 g，共6份，分別置于100 mL量瓶中，各加入一定質(zhì)量的待測(cè)成分對(duì)照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.10 樣品含量測(cè)定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 質(zhì)量控制指標(biāo)的選擇

中藥治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)是化學(xué)成分，化學(xué)成分是復(fù)方發(fā)揮療效的前提。中藥療效的發(fā)揮，是多種化合物協(xié)同作用產(chǎn)生的結(jié)果。中藥單一成分的含量測(cè)定不能反映復(fù)方本身的質(zhì)量，故建立多指標(biāo)的含量測(cè)定以評(píng)價(jià)復(fù)方質(zhì)量勢(shì)在必行[11-13]。

在本復(fù)方的組成中，地骨皮主要有效成分為牛磺酸[14]，牡蠣的有效成分主要為碳酸鈣，均不適合采用HPLC法測(cè)定其含量[15]，故本課題在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究時(shí)，對(duì)?；撬岵捎梅止夤舛确y(cè)定其含量，牡蠣采用化學(xué)方法測(cè)定；且采用本試驗(yàn)方法對(duì)五味子乙素進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)，并未檢測(cè)出該成分，故本課題將在后續(xù)研究中采用薄層色譜法對(duì)五味子乙素進(jìn)行分析。鑒于此，本課題組只測(cè)定了平臟調(diào)神顆粒中黃連、生地黃、葛根、淫羊藿、黃芪、知母、赤芍、丹參的主成分的含量。

3.2 超聲時(shí)間的選擇

在制備供試品溶液時(shí)，筆者以甲醇為提取溶劑，考察了超聲時(shí)間（20、30、40、50、60、70 min）對(duì)待測(cè)成分提取效果的影響。結(jié)果表明，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，待測(cè)成分的含量增加，但當(dāng)超聲時(shí)間超過50 min后，待測(cè)成分的含量增加較少，因此選擇50 min為本試驗(yàn)提取時(shí)間。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

在選擇檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，筆者采用二極管陣列檢測(cè)器在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)供試品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示葛根素和芒果苷在250 nm波長(zhǎng)下，芍藥苷在230 nm波長(zhǎng)下，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和毛蕊花糖苷在220 nm波長(zhǎng)下，丹酚酸B在286 nm波長(zhǎng)下，鹽酸小檗堿在265 nm波長(zhǎng)下，淫羊藿苷在220 nm波長(zhǎng)下吸收較好，因此選擇上述波長(zhǎng)測(cè)定相關(guān)成分。

綜上所述，本文建立的方法適用于平臟調(diào)神顆粒中鹽酸小檗堿、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芍藥苷、芒果苷、丹酚酸B和葛根素含量的同時(shí)測(cè)定。

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（收稿日期：2017-06-08 修回日期：2017-08-10）

（編輯：劉 柳）