銀翹散中抗流感病毒成分與神經(jīng)氨酸酶的分子對接研究

郭小華 朱燕亮 程齊來

中圖分類號 R287；R914.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）17-2351-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.17.11

摘 要 目的：研究銀翹散中17個(gè)主要抗流感病毒成分與神經(jīng)氨酸酶（NA）的結(jié)合模式和相互作用。方法：采用CORINA、UCSF Chimera 1.3、AutoDock Tools 1.5.4等分子對接軟件，將銀翹散中的甘草素、甘草苷、綠原酸、3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸等17個(gè)活性成分及陽性對照扎那米韋的二維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成三維結(jié)構(gòu)，確立其空間坐標(biāo)，再設(shè)置受體蛋白NA的網(wǎng)格，并運(yùn)行對接程序進(jìn)行對接運(yùn)算。以估計(jì)抑制常數(shù)（Ki）和結(jié)合自由能（ΔGbind）為參考指標(biāo)，比較對接分子的虛擬活性差異，并從對接構(gòu)象上分析產(chǎn)生活性差異的原因。結(jié)果：在17個(gè)活性成分中，綠原酸對接的Ki值為1.20 ?mol/L，ΔGbind值為-8.08 kcal/mol（1 kcal=4.184 kJ），優(yōu)于扎那米韋（Ki值為2.26 ?mol/L，ΔGbind值為-7.70 kcal/mol）；3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸對接數(shù)據(jù)最差，Ki值和ΔGbind值分別為149.41 ?mol/L、 -5.22 kcal/mol。在對接構(gòu)象上，綠原酸與扎那米韋相似，在空間上更加匹配NA活性腔的活性位點(diǎn)，占據(jù)了除S5以外的所有活性位點(diǎn)，呈現(xiàn)出與NA較強(qiáng)的結(jié)合作用。3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸的平面分子結(jié)構(gòu)限制了其與NA多個(gè)活性位點(diǎn)結(jié)合，對接構(gòu)象不牢固。結(jié)論：綠原酸可能是銀翹散中最強(qiáng)的抗流感病毒活性成分，其虛擬活性強(qiáng)于扎那米韋；3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸空間上與NA活性腔不匹配，虛擬活性最弱。本研究可為NA抑制劑的開發(fā)提供一定的理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞 銀翹散；活性成分；抗病毒；神經(jīng)氨酸酶；分子對接

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the binding mode and interaction of 17 main antiviral components in Yinqiao powder with neuraminidase （NA）. METHODS： The two-dimensional structure of 17 active components as glycyrrhizin， liquiritin， chlorogenic acid， 3，3′ ，4-trimethoxy ellagic acid in Yinqiao powder and positive control zanamivir were transformed into three-dimensional structure by using CORINA，UCSF Chimera 1.3 and AutoDock Tools 1.5.4 molecular docking software. Then the grids of acceptor protein NA were set up， and the docking program was run to perform the docking operation. Using estimation inhibit constant （Ki） and binding energy （ΔGbind） as reference indexes， the difference of virtual activity of the docking moleculars were compared， and its reasons were analyzed from the docking conformation. RESULTS： In the 17 active components， Ki value for molecule docking of chlorogenic acid was 1.20 ?mol/L， and ΔGbind was -8.08 kcal/mol （1 kcal=4.184 kJ）， which was better than zanamivir （Ki 2.26 ?mol/L， ΔGbind -7.70 kcal/mol）. Ki and ΔGbind of 3，3′ ，4-trimethoxy ellagic acid were 149.41 ?mol/L and -5.22 kcal/mol， which were the worst among 17 compounds. Chlorogenic acid and zanamivir were more closely matched to the active sites of NA active cavity in space from the docking conformation， and occupied all the active chambers except S5， which presented a strong binding effect with NA. The docking conformation of 3，3′ ，4-trimethoxy ellagic acid was not strong as its plane structure restricted the combination with NA active sites. CONCLUSIONS： Chlorogenic acid is the strongest antiviral activity component in the Yinqiao powder， whose virtual activity is even stronger than zanamivir. The virtual activity of 3，3′ ，4-trimethoxy ellagic acid may be the weakest as its mismatching with the NA active cavity. This study may provide some theoretical guidance for the development of NA inhibitors.

KEYWORDS Yinqiao powder； Active component； Antivirus； Neuraminidase； Molecular docking

流感是由流感病毒引起一種常見的疾病，而流感病毒易發(fā)生變異的生物學(xué)特性和傳播速度快的特點(diǎn)，決定了抗流感病毒藥物研發(fā)的必要性。研究發(fā)現(xiàn)，流感病毒增殖后要從位于宿主細(xì)胞的唾液酸殘基中釋放出來并且感染其他宿主細(xì)胞，這一過程中需要神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase，NA）的參與[1]。

NA又稱唾液酸酶，是一種流感病毒表面糖蛋白，在流感病毒復(fù)制和感染過程中起關(guān)鍵作用[2]。NA的晶體結(jié)構(gòu)是一個(gè)四聚體結(jié)構(gòu)，由4個(gè)相同的亞基以二硫鍵形式連接而成[3]。這4個(gè)部分分別被稱為尾、跨膜域、莖和球狀頭。 Stoll V等[4]研究發(fā)現(xiàn)，NA的活性位點(diǎn)具有高極性，其活性區(qū)域有5個(gè)活性位點(diǎn)。在A型和B型流感病毒每個(gè)糖蛋白亞單位表面的口袋中都存在NA的活性位點(diǎn)，并且這些活性位點(diǎn)周圍存在的氨基酸序列均是高度保守的，這有利于NA抑制劑的設(shè)計(jì)和開發(fā)[5]。

銀翹散是由金銀花、連翹、牛蒡子等9味中藥組成的復(fù)方制劑，在臨床上被廣泛應(yīng)用于抗流感治療[6]。其中的金銀花、連翹、牛蒡子和生甘草是主要的抗病毒組分。金銀花中的黃酮類、有機(jī)酸類、三萜皂苷類成分有明顯的抗病毒作用[7]，尤其是有機(jī)酸類的綠原酸對呼吸道病毒的抑制作用明顯[8]；連翹中的連翹苷、連翹酯苷，甘草中的甘草素、甘草苷，牛蒡子中的牛蒡子苷等成分均有抗病毒活性[9]。

研究表明，銀翹散中的活性成分，如甘草中的甘草素、甘草苷、異甘草素、異甘草苷、芒柄花素，連翹中的連翹苷、連翹酯苷，金銀花中的綠原酸、金絲桃苷，薄荷中的醉魚草苷、金合歡素，牛蒡子中的牛蒡子苷、染料木素，淡豆豉中的大豆素、6-甲氧基大豆素及荊芥中的橙皮苷和3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸等[9-14]，均有較好的抗流感病毒作用，作用機(jī)制可能與其抑制NA活性有關(guān)[15]。因此，本文采用分子對接的方法模擬了銀翹散中甘草素、甘草苷等17個(gè)主要的抗病毒成分與NA的結(jié)合模式，并探討其與NA的作用差異，推測可能的構(gòu)效關(guān)系，為NA抑制劑的開發(fā)提供一定理論指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

M4500-N000臺(tái)式電子計(jì)算機(jī)[聯(lián)想（北京）有限公司]；ChemBioDraw Ultra 11.0軟件（CambridgeSoft公司，用于繪制各成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式）；UCSF Chimera 1.3軟件（美國加州大學(xué)）；AutoDock Tools 1.5.4、AutoGrid 4.2、AutoDock 4.2軟件（美國斯克利普斯研究所）；Discovery Studio 2.5 Visualizer、Python 2.5軟件（美國Accelrys公司，用于分子對接）；CORINA工具（http：//www.molecular-networks.com）（美國Molecular Networks GmbH公司，用于配體分子三維結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化）；Brookheaven蛋白數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/pdb.com，用于下載靶蛋白的晶體結(jié)構(gòu)）。

2 方法

2.1 分子對接計(jì)算前處理

2.1.1 配體分子的選取及對接前處理 銀翹散中成分復(fù)雜，其中黃酮類等被認(rèn)為是具有抗流感病毒的活性成分[7]。筆者選取了銀翹散中甘草素、甘草苷等17個(gè)抗流感病毒成分作為分子對接的配體分子，且以NA蛋白原始配體分子（扎那米韋）為陽性對照。各配體分子名稱及結(jié)構(gòu)詳見表1。

將表1中18個(gè)配體分子的平面結(jié)構(gòu)用CORINA工具在線轉(zhuǎn)化成三維結(jié)構(gòu)，并在UCSF Chimera程序中將其置于對接靶蛋白的活性位點(diǎn)處，保存為pdb格式文件。再將此pdb格式文件的配體分子置于AutoDockTools（ADT）軟件中加上電荷和非極性氫，保存為pdbqt格式文件。

2.1.2 受體分子的選取及對接前處理 從Brookheaven蛋白數(shù)據(jù)庫中獲取受體NA的晶體結(jié)構(gòu)，pdb代碼為1A4G[16]。在UCSF Chimera程序中將NA蛋白晶體結(jié)構(gòu)中的水分子、原始配體等剔除，保存為pdb格式文件。再將此pdb格式文件的受體分子置于ADT軟件中加上電荷和非極性氫，保存為pdbqt格式文件。

2.2 分子對接運(yùn)算

在ADT軟件中，設(shè)置pdbqt格式文件的配體分子和受體分子的網(wǎng)格，并運(yùn)行AutoGrid生成必要的圖像文件，最后運(yùn)行AutoDock進(jìn)行分子對接運(yùn)算。以估計(jì)抑制常數(shù)（Inhibit constant，Ki）和結(jié)合自由能（Binding energy，ΔGbind）為參考指標(biāo)，獲取18個(gè)配體分子與NA蛋白對接的ΔGbind和Ki值，并將銀翹散中17個(gè)活性成分的ΔGbind和Ki值與扎那米韋的ΔGbind和Ki值進(jìn)行比較。最后從最優(yōu)構(gòu)象上分析配體分子與NA的結(jié)合模式，從分子水平探討兩者的結(jié)合作用。

3 結(jié)果

3.1 分子對接運(yùn)算結(jié)果

扎那米韋、甘草素等18個(gè)配體分子與NA受體對接的Ki值和ΔGbind值見表2。

如表2所示，扎那米韋（配體分子1）的Ki值和ΔGbind值分別為2.26 ?mol/L和-7.70 kcal/mol，對接的配體分子中數(shù)據(jù)與之接近的為配體分子2（金合歡素）、3（橙皮苷）和6（金絲桃苷），有機(jī)酸類的配體分子15（綠原酸），多酚類的配體分子16（牛蒡子苷）、17（連翹苷）。對接數(shù)據(jù)與扎那米韋相差最大的是配體分子14（3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸），Ki值和ΔGbind值分別為149.41 ?mol/L和 -5.22 kcal/mol。

3.2 分子對接數(shù)據(jù)分析

扎那米韋與NA受體對接的Ki值和ΔGbind值均較小，說明扎那米韋在與NA受體進(jìn)行分子對接時(shí)，空間上相互匹配，結(jié)合比較牢固，構(gòu)象比較穩(wěn)定，對NA蛋白表現(xiàn)出很強(qiáng)的虛擬抑制活性。

銀翹散中17個(gè)成分與NA受體對接的Ki值和ΔGbind值較小的主要有金合歡素、橙皮苷、金絲桃苷、綠原酸、牛蒡子苷、連翹苷等。與扎那米韋對接數(shù)據(jù)接近的是綠原酸、牛蒡子苷，其中綠原酸對接的Ki值和ΔGbind值甚至低于扎那米韋，分別為1.20 ?mol/L和-8.08 kcal/mol，表現(xiàn)出與NA蛋白很強(qiáng)的結(jié)合能力，結(jié)合構(gòu)象也比較穩(wěn)定，可能對NA存在很強(qiáng)的虛擬抑制活性。對接數(shù)據(jù)最不理想的是3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸，Ki值和ΔGbind值分別為149.41 ?mol/L和-5.22 kcal/mol，表現(xiàn)出與NA蛋白較弱的結(jié)合能力，結(jié)合構(gòu)象不穩(wěn)定，對NA的虛擬抑制活性較差。

3.3 分子對接構(gòu)象分析

Stoll V等[4]的研究表明，NA活性腔由5個(gè)活性位點(diǎn)（S1～S5）構(gòu)成。NA活性位點(diǎn)S1主要是靜電區(qū)域，易與配體分子形成鹽橋；S2為帶負(fù)電區(qū)域，主要與配體分子的極性基團(tuán)形成氫鍵相互作用力，是配體分子產(chǎn)生活性的關(guān)鍵區(qū)域之一；S3中的TRP178是一個(gè)關(guān)鍵氨基酸，與配體分子中的疏水基團(tuán)形成疏水作用；S4屬于一個(gè)大的疏水口袋，很難被配體分子占據(jù)；S5中的極性氨基酸GLU274和GLU276也主要與配體分子形成氫鍵相互作用力[4]。利用UCSF Chimera程序分析NA晶體結(jié)構(gòu)，其活性位點(diǎn)分布圖詳見圖1（以棒狀圖和溶劑化圖兩種不同形式體現(xiàn)）。

為了更直觀地反映各成分與NA蛋白的結(jié)合作用，筆者從分子對接構(gòu)象上進(jìn)行分析。將綠原酸和3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸與NA的對接構(gòu)象同扎那米韋與NA對接構(gòu)象進(jìn)行比較，分析該3種配體分子與NA各活性位點(diǎn)的結(jié)合作用。

3.3.1 扎那米韋與NA對接構(gòu)象分析 扎那米韋與NA對接的構(gòu)象詳見圖2。

由圖2B可見，扎那米韋的整個(gè)分子結(jié)構(gòu)基本能占據(jù)NA的活性腔；由圖2A可見，其與活性位點(diǎn)S1、S3、S5結(jié)合緊密。扎那米韋結(jié)構(gòu)中的羧基部分伸入到S1活性位點(diǎn)，羧基上的羥基和羰基分別與周圍的氨基酸TYR408、ARG153、ARG115形成了4個(gè)氫鍵；胍基結(jié)構(gòu)靠近S2活性位點(diǎn)，與氨基酸ASP148形成了氫鍵，但在空間上并未完全占據(jù)該活性位點(diǎn)；乙酰氨基結(jié)構(gòu)與S3活性位點(diǎn)形成疏水作用的同時(shí)，還與該位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸TRP176形成了氫鍵；醇羥基結(jié)構(gòu)則深入S5活性位點(diǎn)，并與該位點(diǎn)的極性氨基酸GLU274形成了氫鍵。S4活性位點(diǎn)類似于一個(gè)大的疏水口袋，很難被配體分子占據(jù)，故扎那米韋沒能與之形成相互作用。

3.3.2 綠原酸與NA對接構(gòu)象分析 綠原酸與NA對接的構(gòu)象詳見圖3。

由圖3B可見，綠原酸與NA的對接構(gòu)象與扎那米韋相似，占據(jù)了NA活性腔的主要活性位點(diǎn)，其中綠原酸結(jié)構(gòu)中的酯鏈部分落在NA活性腔的S1活性位點(diǎn)，酯鏈的羰基氧分別與周圍的氨基酸TYR408、ARG153、ARG115形成了4個(gè)氫鍵，酚羥基結(jié)構(gòu)落入S3活性位點(diǎn)，并與關(guān)鍵氨基酸TRP176形成了氫鍵。

與扎那米韋不同的是，綠原酸結(jié)構(gòu)中的環(huán)己醇部分與S2活性位點(diǎn)的結(jié)合，除了醇羥基與氨基酸ASP148形成氫鍵外，整個(gè)環(huán)己醇結(jié)構(gòu)也嵌入S2活性位點(diǎn)，空間上與之相匹配，結(jié)合較牢固。由此推測，該作用方式可能是綠原酸對接數(shù)據(jù)優(yōu)于扎那米韋的原因之一。另外，綠原酸結(jié)構(gòu)并未伸入到由極性氨基酸構(gòu)成的S5活性位點(diǎn)，提示在對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾時(shí)，可以考慮在酚羥基結(jié)構(gòu)上引入部分極性基團(tuán)，使之延伸靠近S5活性位點(diǎn)，并與周圍氨基酸形成相互作用，有助于增強(qiáng)綠原酸與NA的結(jié)合作用，提高其活性。

3.3.3 3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸與NA對接構(gòu)象分析 3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸與NA對接的構(gòu)象詳見圖4。

由圖4可見，3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸雖然能夠靠近S1和S3活性位點(diǎn)，可與S1活性位點(diǎn)的多個(gè)氨基酸形成了氫鍵，但整個(gè)平面分子在空間上卻很難與其他活性位點(diǎn)結(jié)合，尤其是S2和S5活性位點(diǎn)，導(dǎo)致其與NA結(jié)合不牢固，虛擬抑制活性較差。3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸抗病毒活性的對接數(shù)據(jù)最不理想，主要原因可能是其平面結(jié)構(gòu)限制了其與NA活性腔的結(jié)合。

銀翹散中其他抗病毒活性成分與NA對接的空間構(gòu)象基本相似，因結(jié)構(gòu)存在差異，在與NA結(jié)合時(shí)，結(jié)合位點(diǎn)和相互作用力會(huì)有差別，使得虛擬活性也不盡相同。

4 討論

本研究以上市的NA抑制劑扎那米韋為陽性對照，利用分子對接的方法模擬了銀翹散中主要的17個(gè)抗流感病毒活性成分與NA的相互作用。通過分析各成分與NA的對接數(shù)據(jù)（Ki值、ΔGbind值）發(fā)現(xiàn)，綠原酸、牛蒡子苷、連翹苷、金合歡素、橙皮苷、金絲桃苷與扎那米韋的對接數(shù)據(jù)接近，其中綠原酸的對接數(shù)據(jù)最接近扎那米韋。故筆者推測這6種成分對NA的虛擬抑制活性較強(qiáng)，是銀翹散中主要的抗病毒成分。

從對接構(gòu)象上看，NA活性腔中的S1、S2、S3、S5活性位點(diǎn)是NA抑制劑發(fā)揮作用的主要位點(diǎn)。3，3′ ，4-三甲氧基鞣花酸是一個(gè)平面分子，限制了其與NA多個(gè)活性位點(diǎn)的結(jié)合，導(dǎo)致對接數(shù)據(jù)不理想、對接構(gòu)象不穩(wěn)定、對NA的虛擬抑制活性較弱。綠原酸與扎那米韋的對接構(gòu)象相似，在空間上能與NA活性腔的多個(gè)活性位點(diǎn)結(jié)合，并與周圍的關(guān)鍵氨基酸形成氫鍵等，對接構(gòu)象牢固，表現(xiàn)出對NA較強(qiáng)的虛擬抑制活性。與扎那米韋比較，綠原酸更加嵌入NA活性腔的S2活性位點(diǎn)，表現(xiàn)出更強(qiáng)的結(jié)合能力。但其離由極性氨基酸構(gòu)成的S5活性位點(diǎn)較遠(yuǎn)，與周圍氨基酸形成的相互作用力有限。在后續(xù)的研究過程中，可以考慮在酚羥基結(jié)構(gòu)上引入部分極性基團(tuán)，使之延伸靠近S5活性位點(diǎn)，以增強(qiáng)綠原酸與NA的結(jié)合能力，提高其活性。

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（收稿日期：2018-01-11 修回日期：2018-04-08）

（編輯：劉 萍）