4′7—二乙基射干苷元合成產(chǎn)物中雜質(zhì)的分離純化及鑒定

袁崇均 陳雛 陳帥 羅森 羅恒 王笳

中圖分類號(hào) R284.2；Q946.91 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）23-3208-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.23.09

摘 要 目的：分離純化并鑒定4′ ，7-二乙基射干苷元合成產(chǎn)物中的雜質(zhì)，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法：采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析4′ ，7-二乙基射干苷元合成產(chǎn)物中的雜質(zhì)，然后根據(jù)各雜質(zhì)離子峰的質(zhì)荷比[M+H]+推定其可能結(jié)構(gòu)；采用硅膠柱層析，以氯仿-甲醇（梯度洗脫，20 ∶ 1、10 ∶ 1、8 ∶ 1、6 ∶ 1、5 ∶ 1、3 ∶ 1、2 ∶ 1、1 ∶ 1、0 ∶ 1，V/V）分離純化部分雜質(zhì)，并采用紫外、紅外、核磁共振波譜等技術(shù)鑒定其結(jié)構(gòu)。結(jié)果：在4′ ，7-二乙基射干苷元合成產(chǎn)物中共檢出21個(gè)雜質(zhì)，推定出17個(gè)雜質(zhì)的可能結(jié)構(gòu)；分離純化得到4個(gè)雜質(zhì)單體，分別鑒定為2-羥基-3-甲氧基-4，6，4′ -三乙氧基脫氧安息香（1）、2，6-二羥基-3-甲氧基-4，4′ -二乙氧基脫氧安息香（2）、射干苷元（3）和射干苷（4），其中雜質(zhì)2為新化合物。結(jié)論：本結(jié)果可為4′ ，7-二乙基射干苷元的合成工藝優(yōu)化及質(zhì)量控制提供重要依據(jù)。

關(guān)鍵詞 4′ ，7-二乙基射干苷元；雜質(zhì)；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；鑒定；純化

ABSTRACT OBJECTIVE： To isolate， purify and identify the impurities in the synthesis products of 4′ ，7-diethyl tectorigenin， and to provide reference for its quality control. METHODS： LC-MS/MS was adopted to analyze the impurities in the synthesis products of 4′ ，7-diethyl tectorigenin； the potential structure of each impurity was deduced according to mass-charge ratio [M+H]+ of ion peak. The major impurities were isolated by silica gel column chromatography using chloroform-methanol （gradient elution， 20 ∶ 1， 10 ∶ 1， 8 ∶ 1， 6 ∶ 1， 5 ∶ 1， 3 ∶ 1， 2 ∶ 1， 1 ∶ 1， 0 ∶ 1， V/V）. The structures of the impurities were identified by UV spectroscopy， IR spectroscopy and NMR. RESULTS： Totally 21 impurities were detected in the synthesis products of 4′ ，7-diethyl tectorigenin. The potential structures of 17 impurities were elucidated； 4 impurity monomers were isolated and purified. The impurities were identified as 2-hydroxy-3-methoxy-4，6，4′ -triethoxy deoxybenzoin （1）， 2，6-dihydroxy-3-methoxy-4，4′ -diethoxy deoxybenzoin （2）， tectorigenin （3） and tectoridin （4）. impurity 2 was reported for the first time. CONCLUSIONS： The result can provide important evidence for the optimization of synthesis process and quality control of 4′ ，7-diethyl tectorigenin.

KEYWORDS 4′ ，7-diethyl tectorigenin； Impurity； LC-MS/MS； Identification； Putification

4′ ，7-二乙基射干苷元（4′ ，7-diethyl tectorigenin）即5-羥基-6-甲氧基-4′ ，7-二乙氧基異黃酮，是中藥川射干（Iris tectorum Maxim.）中主要有效成分射干苷元經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾后得到的新型抗病毒候選藥物，具有較強(qiáng)的抗柯薩奇病毒作用，可用于治療由柯薩奇病毒感染引起的心肌炎、小兒肺炎、無(wú)菌性腦膜炎、手足口病等[1-3]。

4′ ，7-二乙基射干苷元是由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院自主研發(fā)，經(jīng)川射干藥材提取分離出射干苷，再水解得到射干苷元，然后在強(qiáng)堿性條件下與硫酸二乙酯反應(yīng)得到4′ ，7-二乙基射干苷元[2]。由于在4′ ，7-二乙基射干苷元的合成過(guò)程中不可避免地會(huì)產(chǎn)生雜質(zhì)，為了控制其合成產(chǎn)物的質(zhì)量，筆者采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（MS）法分析4′ ，7-二乙基射干苷元合成產(chǎn)物中的雜質(zhì)；通過(guò)硅膠柱層析法分離部分雜質(zhì)，并鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，為4′ ，7-二乙基射干苷元的合成工藝優(yōu)化及質(zhì)量控制提供重要依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

RRLC-6410液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）；AVⅡ核磁共振波譜（NMR）儀（德國(guó)Bruker公司）；UV-2401PC紫外（UV）分光光度儀、FTIR8300紅外（IR）檢測(cè)儀（日本Shimadzu公司）；WRS-2微機(jī)熔點(diǎn)測(cè)定儀（上海易測(cè)儀器設(shè)備有限公司）；CPA225D電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

1.2 藥品與試劑

川射干（四川省新荷花中藥飲片股份有限公司，批號(hào)：20131125）由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥種植與資源研究所舒光明研究員鑒定為真品；4′ ，7-二乙基射干苷元對(duì)照品（自制，批號(hào)：20131001，純度：99.48%）；乙酸銨（批號(hào)：20140305）、氫氧化鈉（NaOH，批號(hào)：20140801）、鹽酸（批號(hào)：20140604）、硫酸二乙酯（批號(hào)：20140602）、氯仿（批號(hào)：20140708）、甲醇（批號(hào)：20131204）均購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠；二甲基亞砜（DMSO）、乙腈均為色譜純，水為超純水。

2 方法

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為乙腈-10 mmol/L乙酸胺水溶液（30 ∶ 70，V/V）；流速為0.3 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 ?L。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源（+），噴霧電壓4 000 V，源溫度為100 ℃，霧化氣為氮?dú)猓F化壓力為15 psi，去溶劑氣為氮?dú)?，溫度?00 ℃，流速為10 L/min，碰撞氣為高純氮?dú)?，壓力?.1 MPa；采用全掃描模式對(duì)合成產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 射干苷元的制備

將川射干藥材粉碎過(guò)20目篩，加4倍藥材量70%乙醇加熱回流3次，每次1 h，趁熱過(guò)濾，合并濾液；60 ℃減壓回收乙醇后，得棕黃色浸膏。將所得浸膏加入適量95%乙醇攪拌均勻，靜置沉淀，過(guò)濾得射干苷粗品。再取射干苷粗品，加95%乙醇加熱回流1 h，靜置過(guò)夜，析出淡黃色沉淀，過(guò)濾，沉淀再用95%乙醇加熱回流1次，得射干苷。取射干苷100 g置于1 000 mL圓底燒瓶中，加500 mL 50%乙醇攪拌均勻，再加50 mL鹽酸，加熱回流6 h，趁熱過(guò)濾；將濾液靜置過(guò)夜，析出淡黃色沉淀，過(guò)濾；用水洗滌沉淀至流出液pH=6～7時(shí)，60 ℃減壓干燥得淡黃色射干苷元粉末，純度為95.52%。

2.3 4′ ，7-二乙基射干苷元的合成

取“2.2”項(xiàng)下制備的射干苷元10 g、NaOH 2 g及95%乙醇50 mL置于500 mL圓底燒瓶中，于水浴中加熱沸騰5 min，再加入10 mL硫酸二乙酯，反應(yīng)20 min后，立即用鹽酸調(diào)pH至6～7，加200 mL水?dāng)嚢?，置冷，析出沉淀，過(guò)濾；沉淀經(jīng)洗滌后，60 ℃減壓干燥，即得4′ ，7-二乙基射干苷元合成產(chǎn)物。

2.4 4′ ，7-二乙基射干苷元合成產(chǎn)物中的雜質(zhì)分析

2.4.1 對(duì)照品溶液的制備 取4′ ，7-二乙基射干苷元對(duì)照品適量于100 mL量瓶中，加甲醇超聲（功率：400 W，頻率：58 kHz，下同）溶解并定容，搖勻，即得。

2.4.2 供試品溶液的制備 取“2.3”項(xiàng)下4′ ，7-二乙基射干苷元合成產(chǎn)物5 mg至100 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容，搖勻，即得。

2.4.3 雜質(zhì)分析 分別取“2.4.1”“2.4.2”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液和供試品溶液，根據(jù)“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄總離子流圖和質(zhì)譜信息（保留時(shí)間和質(zhì)荷比[M+H]+）。

2.5 4′ ，7-二乙基射干苷元合成產(chǎn)物中雜質(zhì)的分離

取“2.3”項(xiàng)下4′ ，7-二乙基射干苷元合成產(chǎn)物1.0 g，用20 mL 95%乙醇溶解，過(guò)濾，濾液60 ℃減壓濃縮至5 mL，用5 g 80目硅膠拌勻吸附，干燥，研細(xì)，作為上柱樣品。樣品用200～300目硅膠柱層析，采用氯仿濕法裝柱[4]，氯仿-甲醇梯度洗脫（20 ∶ 1、10 ∶ 1、8 ∶ 1、6 ∶ 1、5 ∶ 1、3 ∶ 1、2 ∶ 1、1 ∶ 1、0 ∶ 1，V/V），收集洗脫液（每50 mL為一份）。根據(jù)薄層色譜[展開劑：氯仿-甲醇-甲酸（10 ∶ 1 ∶ 0.2，V/V/V）]的檢測(cè)結(jié)果，合并比移值相等的流份，減壓回收溶劑至干，再重結(jié)晶，即得部分雜質(zhì)的單體化合物。測(cè)定各單體化合物的熔點(diǎn)（mp）、UV、IR、ESI-MS、1H- NMR及13C-NMR等相關(guān)數(shù)據(jù)，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行推定和鑒定。

3 結(jié)果

3.1 4′ ，7-二乙基射干苷元合成產(chǎn)物中的雜質(zhì)分析結(jié)果

4′ ，7-二乙基射干苷元對(duì)照品溶液的離子流圖見(jiàn)圖1A；4′ ，7-二乙基射干苷元合成產(chǎn)物的離子流圖見(jiàn)圖1B。

由圖1B可知，合成產(chǎn)物中有22個(gè)化合物（編號(hào)：1～22號(hào)）其中包括目標(biāo)產(chǎn)物4′ ，7-二乙基射干苷元（13號(hào)），其余為合成產(chǎn)物中的雜質(zhì)。4′ ，7-二乙基射干苷元合成產(chǎn)物的質(zhì)譜信息見(jiàn)表1。

3.2 部分雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)推定

4′ ，7-二乙基射干苷元化學(xué)名為4′ ，5，7-三羥基-6-甲氧基異黃酮，含有3個(gè)酚羥基；理論上，其與硫酸二乙酯進(jìn)行乙基化反應(yīng)時(shí)應(yīng)有7個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物生成，即一乙基射干苷元類化合物3個(gè)，二乙基射干苷元類化合物3個(gè)，三乙基射干苷元1個(gè)。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]，異黃酮類化合物在強(qiáng)堿性條件下，可降解為脫氧安息香類化合物（即異黃酮C環(huán)開環(huán)衍生物，含有4個(gè)酚羥基）和苯乙酮類化合物等。根據(jù)各雜質(zhì)離子峰的[M+H]+，推定各雜質(zhì)的可能結(jié)構(gòu)[7]。合成產(chǎn)物中部分雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)推定結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2可知，4′ ，7-二乙基射干苷元合成產(chǎn)物中的雜質(zhì)，是由于射干苷元含有多個(gè)酚羥基造成取代基位置及個(gè)數(shù)的不同，以及射干苷元在強(qiáng)堿條件下C環(huán)發(fā)生開環(huán)而產(chǎn)生。推定出17個(gè)雜質(zhì)的可能結(jié)構(gòu)，而9、10、16、22號(hào)雜質(zhì)，根據(jù)其離子峰的[M+H]+和文獻(xiàn)資料，不足以確定其結(jié)構(gòu)，故不作討論。

3.3 部分雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定

根據(jù)“2.5”項(xiàng)下方法分離得到4個(gè)雜質(zhì)單體化合物，化合物1（20 mg）、7（80 mg）、19（20 mg）、21（40 mg）。

化合物1：淡黃色針晶（甲醇）。mp：214～216 ℃；電噴霧電離ESI-MS（m/z）：299[M-H]-；1H-NMR（DMSO，400 MHz）δ：13.09（1H，s，5-OH），10.77（1H，s，7-OH），9.58（1H，s，4′ -OH），8.34（1H，s，H-2），7.37（2H，d，J=8.5 Hz，H-2′ ，6′ ），6.82（2H，d，J=8.5 Hz，H-3′ ，5′ ），6.50（1H，s，H-8），3.74（3H，s，6-OCH3）。以上理化性質(zhì)和光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[3]基本一致，因此，鑒定化合物為射干苷元。

化合物7：淡黃色結(jié)晶性粉末（無(wú)水乙醇）。mp：137～138 ℃；UVλmax：288 nm；IRνmax：1 636，1 612，1 585， 1 516，1 500，1 400，1 344，1 248，1 190，1 020；ESI-MS（m/z）：347[M+H]+；1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：13.32（1H，s，6-OH），7.17（2H，d，J=8.4 Hz，H-2′ ，H-6′ ），6.87（1H，s，2-OH），6.86（2H，d，J=8.4 Hz，H-3′ ，H-5′ ），6.03（1H，s，H-5），4.36（2H，s，-CH2-），4.10（2H，q，4-CH2），4.02（2H，q，4′ -CH2），3.86（3H，s，6-OCH3），1.47（3H，t，4-CH3），1.40（3H，t，4′ -CH3）；13C-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：103.5（C-1），157.8（C-2），127.9（C-3），151.2（C-4），93.2（C-5），157.6（C-6），48.6（C-7），203.1（C-8），126.9（C-1′ ），130.8（C-2′ ，6′ ），114.4（C-3′ ，5′ ），162.1（C- 4′ ），14.6，63.4（4′ -OCH2CH3），14.8，64.4（4-OCH2CH3）。以上理化性質(zhì)和光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[4]基本一致，因此，鑒定化合物為2，6-二羥基-3-甲氧基-4，4′ -二乙氧基脫氧安息香。

化合物19：白色結(jié)晶性粉末（70%乙醇）。mp：252～253 ℃；ESI-MS（m/z）：461[M-H]-；1H-NMR（DMSO，400 MHz）δ：12.92（1H，s，5-OH），9.58（1H，s，4′ -OH），8.44（1H，s，H-2），7.39（2H，d，J=8.5 Hz，H-2′ ，6′ ），6.82（2H，d，J=8.5 Hz，H-3′ ，5′ ），6.85（1H，s，H-8），5.07（1H，d，J=8.0Hz，H-1″ ），3.80（3H，s，6-OCH3）。以上理化性質(zhì)和光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[3]基本一致，因此，鑒定化合物為射干苷。

化合物21：白色晶體（無(wú)水乙醇）。mp：107～109 ℃；UVλmax：283 nm；ESI-MS（m/z）：375[M+H]+；IRνmax：2 986，1 618，1 587，1 574，1 489，1 476，1 387，1 344， 1 260，1 242，1 190，1 161；1H-NMR（CDCl3，400 MHz） δ：13.24（1H，s，2-OH），7.14（2H，d，J=8.4 Hz，H-2′ ，6′ ），6.87（2H，d，J=8.4 Hz，H-3′ ，H-5′ ），6.21（1H，s，H-5），4.36（2H，s，7-CH2），4.28（2H，q，4-CH2），4.10（3H，t，4′ -CH3），4.09（2H，q，6-CH2），4.02（2H，q，4′ -CH2），3.79（3H，s，3-OCH3），1.47（3H，t，4-CH3），1.45（3H，t，6-CH3）；13C-NMR（CDCl3，600 MHz） δ：111.0（C-1），158.9（C-2），131.3（C-3），152.8（C-4），97.2（C-5），157.7（C-6），48.9（C-7），203.1（C-8），127.4（C-1′ ），135.1（C-2′ ，6′ ），114.5（C-3′ ，5′ ），158.1（C-4′ ），14.9，63.3（4′ - OCH2CH3），15.1，64.6（4-OCH2CH3），16.0，70.1（6- OCH2CH3）。鑒定此化合物為2-羥基-3-甲氧基-4，6，4′ -三乙氧基脫氧安息香（新化合物）。

根據(jù)各化合物的mp、UV、IR、ESI-MS、1H-NMR及13C-NMR等相關(guān)數(shù)據(jù)，確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，各化合物結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2。

4 討論

在化合物的制備反應(yīng)過(guò)程中會(huì)不可避免地產(chǎn)生雜質(zhì)，故研究合成產(chǎn)物的雜質(zhì)，有利于了解合成的原理、過(guò)程以及合成方法的合理性，以期對(duì)工藝進(jìn)行評(píng)判及改進(jìn)。從本研究的試驗(yàn)結(jié)果可知，4′ ，7-二乙基射干苷元合成產(chǎn)物的雜質(zhì)過(guò)多，射干苷元乙基化反應(yīng)，可先后生成一乙基、二乙基、三乙基射干苷元類化合物；合成產(chǎn)物中檢出大量的射干苷元C環(huán)開環(huán)類化合物，可能的原因是反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，氫氧化鈉用量過(guò)多，本課題組在后續(xù)的合成工藝優(yōu)化中也會(huì)進(jìn)一步探究。已上市藥物的制劑或原料藥的雜質(zhì)研究文獻(xiàn)報(bào)道較多[8-12]，但不能直接反映化合物合成情況，且由于雜質(zhì)含量較低（在原料藥中多在1%以下），故雜質(zhì)的分離純化比較困難，對(duì)其結(jié)構(gòu)大多只能推測(cè)。本研究將4′，7-二乙基射干苷元合成產(chǎn)物直接進(jìn)行LC-MS/MS測(cè)定，結(jié)果可直觀地反映出合成的情況，且分離得到部分雜質(zhì)并鑒定了其化學(xué)結(jié)構(gòu)，可為4′，7-二乙基射干苷元合成產(chǎn)物的雜質(zhì)分析提供對(duì)照品，為其質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2018-08-01 修回日期：2018-10-10）

（編輯：唐曉蓮）