大鼠體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)中陽(yáng)性藥環(huán)磷酰胺和甲基磺酸乙酯給藥周期的篩選研究

李麗麗 楊林 謝鋒 辛艷飛 張升 陳嬌婷 宣堯仙 由振強(qiáng)

中圖分類號(hào) R99；R979.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）23-3198-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.23.07

摘 要 目的：篩選大鼠體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)中陽(yáng)性藥環(huán)磷酰胺（CP）和甲基磺酸乙酯（EMS）的給藥周期。方法：將SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、CP組（40 mg/kg，腹腔注射）和EMS組（100 mg/kg，灌胃），每組9只，每24 h給藥1次，連續(xù)給藥4次。分別于第2、3、4次給藥后3 h（即首次給藥后27、51、75 h）各組隨機(jī)選取3只大鼠，處死并收集肝和胃樣本，經(jīng)過(guò)制備單細(xì)胞懸液、制片、裂解、解鏈、電泳及染色后，使用Comet Assay Ⅳ彗星試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，以彗星尾部DNA百分比（Tail DNA%）、尾長(zhǎng)（TL）和尾矩（TM）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最佳給藥周期。結(jié)果：空白對(duì)照組大鼠3個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)肝和胃的Tail DNA%、TL、TM差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明彗星試驗(yàn)體系比較穩(wěn)定。與空白對(duì)照組比較，CP組和EMS組大鼠3個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)肝和胃的Tail DNA%、TL（27 h的胃除外）、TM均明顯升高（P<0.05）。其中，CP組大鼠3個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)間肝的Tail DNA%、TL、TM差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），胃的Tail DNA%、TL均在給藥51 h時(shí)最大，TM隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)而升高；EMS組大鼠肝的Tail DNA%、胃和肝的TM均隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。EMS組大鼠胃的Tail DNA%、肝和胃的TL均在給藥51 h時(shí)最大。結(jié)論：在進(jìn)行體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)時(shí)，建議CP和EMS的給藥周期是每24 h給藥1次，連續(xù)給藥3次。

關(guān)鍵詞 體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)；環(huán)磷酰胺；甲基磺酸乙酯；給藥周期；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To screen the dosing period of positive drug cyclophosphamide （CP） and ethyl methanesulfonate （EMS） in alkaline comet assay of rats in vivo. METHODS： SD rats were randomly divided into blank control group， CP group （40 mg/kg， i.p.） and EMS group （100 mg/kg， i.g.）， 9 rats in each group， every 24 h， for consecutive 4 times. 3 h after secondary， third and forth medication （27， 51， 75 h after first medication）， 3 rats were randomly selected and sacrificed in each group. Liver and stomach samples were collected. After single cell suspension preparation， production， lysis， chain breaking， electrophoresis and dyeing， the evaluation indicators， including tail DNA%， tail length （TL） and tail moment （TM）， Comet Assay Ⅳ comet assay data analysis system was used to screen the optimal dosing period. RESULTS： There was no statistical significance in Tail DNA%， TL and TM of liver and stomach in blank control group at 3 test time points （P>0.05）， indicating that the comet assay system was stable. Tail DNA%， TL （except for stomach at 27 h） and TM of liver and stomach in CP and EMS groups were increased significantly， compared with blank control group （P<0.05）. There was no statistical significance in Tail DNA%， TL and TM of liver in CP group at the three test time points （P>0.05）， tail DNA% and TL of stomach in CP group were maximal at 51 h. TM was increased with dosing period. Tail DNA% of liver in EMS group， TM of stomach and liver were increased with dosing period. Tail DNA% of the stomach， TL of liver and stomach were the highest at 51 h in EMS group. CONCLUSIONS： During in vivo alkaline comet assay， it is recommended that CP and EMS be administered once every 24 h and three times continuously.

KEYWORDS Alkaline comet assay in vivo； Cyclophosphamide； Ethyl methanesulfonate； Dosing period； Rats

彗星試驗(yàn)（Comet assay），又稱單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)（Single cell gel electrophoresis assay），是一種快速、簡(jiǎn)單、可視化、靈敏的試驗(yàn)技術(shù)，可以直接測(cè)量和分析體內(nèi)外細(xì)胞的核DNA損傷[1-2]。彗星試驗(yàn)被廣泛應(yīng)用于遺傳毒性試驗(yàn)、人體生物監(jiān)測(cè)和生態(tài)遺傳毒理學(xué)等研究中[3]。彗星試驗(yàn)又分為中性彗星試驗(yàn)（Neutral comet assay）和堿性彗星試驗(yàn)（Alkaline comet assay），中性彗星試驗(yàn)常用于檢測(cè)雙鏈斷裂的DNA損傷，堿性彗星試驗(yàn)則更敏感，用于檢測(cè)包括單鏈和雙鏈斷裂的少量的DNA損傷。環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CP）與甲基磺酸乙酯（Ethyl methanesulfonate，EMS）是遺傳毒性常見(jiàn)的陽(yáng)性藥物，其中CP是一種廣譜抗腫瘤藥，常用于治療白血病[4]、血管炎[5]等；EMS是一種重要的突變誘導(dǎo)劑，可誘導(dǎo)動(dòng)物[6]、植物[7-8]以及微生物[9]發(fā)生突變，且常存在于需要使用含有甲磺酰基團(tuán)的化學(xué)合成過(guò)程中，已報(bào)道其具有基因毒性[10]。但是CP和EMS在藥理與毒理試驗(yàn)中作為陽(yáng)性藥物的給藥周期并沒(méi)有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)供研究者進(jìn)行參考。故本研究以CP和EMS為陽(yáng)性藥物，運(yùn)用堿性彗星試驗(yàn)進(jìn)行大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，基于大鼠的肝細(xì)胞和胃細(xì)胞，篩選體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)的給藥周期。

1 材料

1.1 儀器

CometAssay?ES彗星試驗(yàn)電泳系統(tǒng)（美國(guó)Trevigen公司）；Comet Assay Ⅳ彗星試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)（英國(guó)Instem公司）；Nikon ECLIPSE E600熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 藥品與試劑

CP、EMS對(duì)照品（美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：101767552、BCBS6100V，純度：≥95%）；CometAssay?彗星試驗(yàn)試劑盒（美國(guó)Trevigen公司，批號(hào)：39280D17）；SYBR?Green熒光染液（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：20170418）；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠27只，♂，7～9周齡，體質(zhì)量為（200±20） g，購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK- （浙）2014-001，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)為1710100007。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 500 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA） 取80 mL dH2O，約2 g氫氧化鈉（NaOH），14.6 g EDTA，調(diào)pH至8.0后，加入dH2O定容至100 mL。

2.1.1 組織細(xì)胞切碎液 取500 mmol/L EDTA 2 mL至48 mL無(wú)鈣、鎂，無(wú)酚紅的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，使用前加入5.6 mL二甲亞砜（DMSO）溶液，4 ℃預(yù)冷。

2.1.3 堿性解鏈溶液（pH>13） 取NaOH 0.4 g、200 mmol/L EDTA 250 μL，加dH2O定容至50 mL。

2.1.4 堿性電泳緩沖液 NaOH 8 g，500 mmol/L EDTA 2 mL，NaOH溶解后加dH2O定容至1 L，存放于4 ℃。

2.1.5 1 mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液（Tris-HCl溶液） 取Tris 12.12 g，dH2O 80 mL，濃HCl 5～6 mL，調(diào)pH至7.5后，加入dH2O定容至100 mL。

2.1.6 Tris-EDTA緩沖溶液（TE緩沖溶液） 取1 mL 1 mol/L Tris-HCl，200 μL 500 mmol/L EDTA，加入dH2O定容至100 mL。

2.1.7 CP溶液和EMS溶液 均用生理鹽水作為溶劑將CP和EMS配制成所需濃度的溶液。

2.2 分組與給藥

將大鼠隨機(jī)分成3組，分別為空白對(duì)照組、CP組和EMS組，每組9只。CP組大鼠腹腔注射CP溶液，給藥劑量為40 mg/kg；EMS組大鼠灌胃EMS溶液，給藥劑量為100 mg/kg；空白對(duì)照組大鼠灌胃生理鹽水，給藥體積為10 mL/kg。3組大鼠每隔24 h給藥1次，連續(xù)給藥4次，其中CP和EMS的劑量為藥物遺傳毒理學(xué)研究中陽(yáng)性藥物的常用劑量[11]，分別于第2、3、4次給藥后3 h，即首次給藥后27、51、75 h，每組隨機(jī)抽取3只大鼠，灌胃1%戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉，放血處死，解剖并收集肝、胃樣本。

2.3 單細(xì)胞懸液的制備

2.3.1 肝單細(xì)胞懸液 用10 mL注射器從大鼠肝門靜脈緩慢推注預(yù)冷的生理鹽水直至肝臟鼓起發(fā)白，剪下左側(cè)肝葉一小塊組織（1 mm×2 mm），每只大鼠剪切組織塊大小應(yīng)盡量保持一致。將剪下的組織塊放入預(yù)冷的切碎液中反復(fù)清洗除去殘留血液。將洗干凈的肝組織塊放入5 mL離心管內(nèi)，加入3 mL切碎液，用眼科剪適當(dāng)剪碎組織塊以釋放細(xì)胞，靜置5 min。用1 mL移液器輕輕吹打數(shù)十次后過(guò)篩（孔徑40 μm），保留上清液。用預(yù)冷的切碎液調(diào)整上清液中的肝細(xì)胞濃度為1×108個(gè)/mL用于制片。

2.3.2 胃單細(xì)胞懸液 沿胃大彎將胃剪開(kāi)，用預(yù)冷的生理鹽水清洗胃部。胃表面上皮用塑料刮板刮幾次后用冷的切碎液充分沖洗。用塑料刮板輕輕刮胃黏膜5次以上釋放細(xì)胞。隨后用3 mL 切碎液將刮下的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸浮液，用1 mL槍輕輕吹打數(shù)十次后過(guò)篩（孔徑40 μm），保留上清液。用預(yù)冷的切碎液調(diào)整上清液中的胃細(xì)胞濃度為1×108個(gè)/mL用于制片。

2.4 制片

在沸水燒杯中溶化瓊脂糖 5 min。溶化后，將瓊脂糖放入37 ℃水浴中至少20 min使其冷卻。以1 ∶ 10 （V/V）的比例將單細(xì)胞懸浮液與溶化的瓊脂糖混合在1.5 mL離心管中，吹打均勻后立即吸取50 μL至載玻片的樣品區(qū)域中，確保樣品區(qū)域的完整覆蓋。將載玻片平放在4 ℃的黑暗中（冰箱）10 min。當(dāng)載玻片樣品區(qū)域的邊緣出現(xiàn)一個(gè)0.5 mm的清晰的環(huán)時(shí)，表示制片完成，可進(jìn)行下一步操作。

2.5 裂解、解鏈及電泳

將載玻片置于4 ℃的裂解液[裂解液使用前加入 10 ∶ 1（V/V）的DMSO]中浸泡30～60 min。裂解結(jié)束后將載玻片浸入新鮮制備的堿性解鏈液中，pH>13，在室溫下浸泡20 min。在此期間，將電泳儀在冰箱內(nèi)降溫20 min。解鏈完成后，在電泳儀內(nèi)加入約850 mL的4 ℃堿性電泳緩沖液，將載玻片放入電泳載玻臺(tái)上（載玻片標(biāo)簽與黑色陰極相鄰），并用載玻臺(tái)覆蓋層覆蓋。在冷卻槽內(nèi)放入冰袋。CometAssay?ES彗星試驗(yàn)電泳系統(tǒng)電源設(shè)置為21 V/cm，電泳時(shí)間為30 min。

2.6 染色及觀察

電泳結(jié)束后，將載玻片在4 ℃的dH2O中輕輕浸泡2次，每次5 min，然后在70%乙醇中浸泡脫水5 min。然后將載玻片在37 ℃下干燥10～15 min。SYBR?Green熒光染液用TE緩沖溶液稀釋20倍，用移液槍取100 μL稀釋后的熒光染液均勻鋪到每個(gè)干燥的瓊脂糖上，并在室溫下避光染色30 min。染色結(jié)束后，輕輕敲打載玻片除去多余的熒光染液，并在水中簡(jiǎn)單浸泡。在37 ℃下完全干燥后，置于波長(zhǎng)為450～490 nm的熒光顯微鏡下觀察。

2.7 堿性彗星試驗(yàn)結(jié)果的收集

本試驗(yàn)使用Comet Assay Ⅳ彗星試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)對(duì)觀察到的細(xì)胞進(jìn)行分析評(píng)分，并采用彗星尾部DNA百分比（Tail DNA%）、尾長(zhǎng)（彗星頭部末端到彗星尾末端的距離，TL）和尾矩（尾長(zhǎng)與尾部DNA百分比的乘積，TM）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。每只大鼠的肝、胃分別隨機(jī)分析150個(gè)細(xì)胞。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3組大鼠不同給藥時(shí)間的彗星試驗(yàn)典型圖見(jiàn)圖1。

3.1 肝和胃的Tail DNA%

空白對(duì)照組大鼠3個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)Tail DNA%差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明試驗(yàn)體系比較穩(wěn)定。與空白對(duì)照組比較，CP組和EMS組大鼠3個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)肝和胃的Tail DNA%均明顯升高（P<0.05）。其中CP組大鼠3個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)間肝的Tail DNA%差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），胃的Tail DNA%在51 h時(shí)最大；EMS組大鼠肝的Tail DNA%隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，胃的Tail DNA%也在51 h時(shí)最大。說(shuō)明CP和EMS首次給藥后51 h的Tail DNA%最敏感。3組大鼠肝和胃中的Tail DNA%的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 肝和胃的TL

空白對(duì)照組大鼠3個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)TL差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明試驗(yàn)體系比較穩(wěn)定。與空白對(duì)照組比較，CP組和EMS組大鼠除了首次給藥后27 h胃的TL差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P>0.05），其余檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)肝和胃的TL均明顯升高（P<0.05）。其中，CP組大鼠3個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)間肝的TL差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），胃的TL在51 h時(shí)最大；EMS組大鼠肝和胃的TL均在51 h時(shí)最大。說(shuō)明CP和EMS首次給藥后51 h的TL最敏感。3組大鼠肝和胃中的TL的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 肝和胃的TM

空白對(duì)照組大鼠3個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)TL差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明試驗(yàn)體系比較穩(wěn)定。與空白對(duì)照組比較，CP和EMS組大鼠3個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)肝和胃的TM均明顯升高（P<0.05）。其中，CP組大鼠3個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)間肝的TM差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），胃的TM隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)而升高；EMS組大鼠肝和胃的TM均隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。3組大鼠肝和胃中的TM的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

4 討論

遺傳毒性研究是藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容，在我國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）于2007年頒布的《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中，推薦的標(biāo)準(zhǔn)組合為一項(xiàng)體外細(xì)菌基因突變?cè)囼?yàn)、一項(xiàng)采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行的體外染色體損傷評(píng)估試驗(yàn)，或體外小鼠淋巴瘤TK基因突變?cè)囼?yàn)、一項(xiàng)采用嚙齒類動(dòng)物造血細(xì)胞進(jìn)行的體內(nèi)染色體損傷試驗(yàn)。近年來(lái)隨著對(duì)遺傳毒性認(rèn)識(shí)的不斷提高，遺傳毒性新技術(shù)和新方法得到完善與發(fā)展，并積累了大量的數(shù)據(jù)，如體外微核試驗(yàn)、體內(nèi)彗星試驗(yàn)、轉(zhuǎn)基因模型。同時(shí)，體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)假陽(yáng)性率過(guò)高的情況引起了廣泛的關(guān)注[12-14]。鑒于上述原因，國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)議（ICH）遺傳毒性指導(dǎo)委員會(huì)于2006年6月啟動(dòng)遺傳毒性指導(dǎo)原則的修訂工作，并于2011年11月正式修訂完成，并推薦給歐盟、美國(guó)和日本采納和使用。為了保證藥物遺傳毒性研究的準(zhǔn)確性和可靠性，我國(guó)CFDA參照ICH、美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）、經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）相關(guān)遺傳毒性指導(dǎo)原則于2018年3月頒布了新的藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則。新指導(dǎo)原則推薦的標(biāo)準(zhǔn)組合增加了可選性，體內(nèi)彗星試驗(yàn)是其推薦的一項(xiàng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，該方法是一項(xiàng)可以直接檢測(cè)核DNA損傷的敏感實(shí)驗(yàn)方法，可以檢測(cè)DNA單/雙鏈損傷、堿性不穩(wěn)定位點(diǎn)、DNA交聯(lián)等多種損傷類型，因此該實(shí)驗(yàn)方法是研究突變修飾和遺傳性改變的有效手段。

前期已有研究人員利用EMS和CP建立體內(nèi)彗星試驗(yàn)的方法[11，15-16]，其主要是對(duì)EMS和CP誘導(dǎo)的DNA損傷的劑量進(jìn)行探討。CP是常用的遺傳毒性評(píng)價(jià)的陽(yáng)性藥物，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)給藥途徑一般為腹腔注射，但大部分藥物的給藥方式為口服給藥，為保證給藥方式的一致性，本研究還選取了口服藥物EMS作為遺傳毒理學(xué)評(píng)價(jià)的陽(yáng)性藥物。本研究參考前期研究的EMS和CP劑量，就二者給藥周期對(duì)彗星試驗(yàn)結(jié)果的影響進(jìn)行研究。根據(jù)《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》要求，彗星試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)指標(biāo)為彗星Tail DNA%、TL和TM，其中以Tail DNA%為主。本研究也對(duì)彗星試驗(yàn)的Tail DNA%、TL和TM進(jìn)行了分析，在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)中，空白對(duì)照組大鼠的Tail DNA%、TL和TM均處于一個(gè)比較穩(wěn)定的數(shù)值，說(shuō)明彗星試驗(yàn)系統(tǒng)比較穩(wěn)定。EMS和CP誘導(dǎo)的DNA損傷均能通過(guò)彗星Tail DNA%、TL和TM進(jìn)行反映，其中以Tail DNA%和TM最敏感，在3個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)中均明顯高于空白對(duì)照組，而TL在首次給藥后27 h胃的檢測(cè)中與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。OECD建議將Tail DNA%作為彗星試驗(yàn)最主要參數(shù)，其他參數(shù)可作為參考，因此在今后的彗星試驗(yàn)的分析過(guò)程中建議以彗星Tail DNA%作為主要的評(píng)價(jià)指標(biāo)，TL和TM作為補(bǔ)充指標(biāo)。

在本研究中，筆者選取了胃和肝作為彗星試驗(yàn)檢測(cè)的靶器官，其中肝是藥物在體內(nèi)代謝的主要靶器官，而在進(jìn)行藥物安全性評(píng)價(jià)過(guò)程中，口服給藥是最常見(jiàn)的給藥方式，因此選取胃（與藥物接觸的主要器官）作為口服給藥的檢測(cè)靶器官。研究結(jié)果顯示，胃和肝均是比較敏感的靶器官，且在EMS和CP首次給藥后51 h和75 h胃的Tail DNA%、TL和TM比肝更敏感。在給藥后的檢測(cè)點(diǎn)中，筆者選取了首次給藥后27、51、75 h進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在首次給藥后以51 h的結(jié)果靈敏度和彗星圖片的清晰度最佳。日本替代方法驗(yàn)證中心（JaCVAM）聯(lián)合驗(yàn)證結(jié)果表明，連續(xù)3 d給藥能更靈敏地檢測(cè)化合物遺傳毒性作用，故一般選擇給藥周期為3 d[17]，OECD還推薦將體內(nèi)彗星試驗(yàn)整合到亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)中，以減少動(dòng)物的使用。本研究結(jié)果同樣表明連續(xù)給藥3次后檢測(cè)效果最佳。

綜上所述，在對(duì)藥物進(jìn)行體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)時(shí)，建議陽(yáng)性藥CP和EMS的給藥周期是每24 h給藥1次，連續(xù)給藥3次。

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（收稿日期：2018-06-03 修回日期：2018-09-27）

（編輯：鄒麗娟）