當(dāng)歸根、莖中總黃酮的提取工藝優(yōu)化

羅旭東　李成義　李旭　強(qiáng)正澤　馮曉莉　王明偉　李碩　王燕

中圖分類號(hào) R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）03-0364-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.03.18

摘 要 目的：優(yōu)化當(dāng)歸根、莖中總黃酮的提取工藝。方法：以提取溶劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)等為考察因素，以提取液中總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化當(dāng)歸根、莖中總黃酮的回流提取工藝。結(jié)果：當(dāng)歸根、莖中總黃酮最優(yōu)提取工藝分別為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、50%，料液比1 ∶ 40、1 ∶ 30，提取時(shí)間1.3、1.7 h，均提取2次；驗(yàn)證試驗(yàn)中總黃酮含量分別為7.253 6、25.144 1 mg/g（RSD=1.57%、1.49%，n=3），與模型預(yù)測(cè)值（6.942 8、25.703 5 mg/g）的相對(duì)誤差分別為4.28%、2.24%。結(jié)論：優(yōu)化后的當(dāng)歸根、莖中總黃酮的提取工藝方法簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性和可預(yù)測(cè)性較好。

關(guān)鍵詞 當(dāng)歸；根；莖；總黃酮；單因素試驗(yàn)；Box-Behnken設(shè)計(jì)；響應(yīng)面法；回流提?。还に噧?yōu)化

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize reflux extraction technology of total flavonoids from the roots and stems of Angelica sinensis. METHODS： The reflux extraction technology of total flavonoids from the roots and stems of A. sinensis was optimized by Box-Behnken design-response methodology based on single factor test using volume fraction of extraction solvent ethanol， solide-liquid ration， extraction time， extraction times as investigation factors， the content of total flavonoids in extract as evaluation index. RESULTS： The optimal extraction technology of total flavonoids from the roots and stems of A. sinensis was that volume fractions of ethanol were 70% and 50%； solid-liquid ratios were 1 ∶ 40 and 1 ∶ 30； extraction time were 1.3 h and 1.7 h； The number of extraction times is two times. In verification test， the contents of total flavonoids were 7.253 6， 25.144 1 mg/g （RSD=1.57%， 1.49%， n=3）； relative errors of those to predicted value （6.942 8， 25.703 5 mg/g） were 4.28%， 2.24%. CONCLUSIONS： Optimized extraction technology for total flavonoids from the roots and stems of A. sinensis is simple， reproducible and predictable.

KEYWORDS Angelica sinensis； Roots； Stems； Total flavonoids； Single factor test； Box-Behnken design； Response methodology； Reflux extraction； Technology optimization

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸[Angelica sinensis （Oliv.）Diels]的干燥根，味甘、辛，性溫，能補(bǔ)血和血、調(diào)經(jīng)止痛、潤(rùn)燥滑腸，臨床上主要用于血虛萎黃、眩暈心悸、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、腸燥便秘等證[1]。當(dāng)歸中主要含苯酞、黃酮、多糖、有機(jī)酸等多種類型的化學(xué)成分[2-4]，其中黃酮類化合物具有抗衰老、抗菌、保肝、降壓、抗癌、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[5-9]，且其在人體內(nèi)不能合成，只能外源性獲取[6]。因此，對(duì)黃酮類化合物活性成分的提取具有重要的研究?jī)r(jià)值。

當(dāng)歸藥食兩用歷史悠久，歷代本草均對(duì)其有記載。經(jīng)筆者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2014年甘肅岷縣當(dāng)歸種植面積達(dá)1.01萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量2×107 kg左右[10]。但由于在傳統(tǒng)用藥習(xí)慣中，當(dāng)歸僅以根入藥，故每年采收后當(dāng)歸大量的地上部分被丟棄，不僅污染了產(chǎn)地環(huán)境而且造成了資源的極大浪費(fèi)。已有研究表明，當(dāng)歸地上部分中含有很多活性成分，如具有抗菌、抗凝血活性的金絲桃苷、綠原酸等成分[11-12]。近年來(lái)，對(duì)中藥資源進(jìn)行合理利用并擴(kuò)大其藥用部位等研究已被廣泛關(guān)注，但關(guān)于當(dāng)歸地上部分莖總黃酮的提取和含量測(cè)定卻鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究以乙醇為提取溶劑，采用單因素試驗(yàn)與Box-Behnken設(shè)計(jì)相結(jié)合的方法，以提取時(shí)間、料液比、乙醇的體積分?jǐn)?shù)、提取次數(shù)等為考察因素，以總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化當(dāng)歸根、莖中總黃酮的回流提取工藝，為當(dāng)歸莖的綜合開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

UV-2401-PC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）； BT25S型電子分析天平（精度：1/100 000）、 BT124S型電子分析天平（精度：1/10 000）均來(lái)源于北京賽多利斯儀器有限公司；DK-98-ⅡA型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；101-1型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（北京市永興儀器有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

采集甘肅岷縣十里鎮(zhèn)2016年10月初當(dāng)歸根、莖（海拔：2 313.1 m，經(jīng)度：104°0′ 10″ ，緯度：34°26′ 2″ ），經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)李成義教授鑒定為傘形科植物當(dāng)歸的根、莖；蘆丁對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：B20771，純度：98%）；無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測(cè)定

2.1.1 供試品溶液的制備 精密稱取樣品粉末2.0 g，用80%乙醇為溶劑，稱質(zhì)量；回流提取1 h，取出，冷卻至室溫，稱質(zhì)量并用80%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過(guò)濾，濾液用80%乙醇定容于 100 mL量瓶中，搖勻，即得。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精確稱取干燥至恒質(zhì)量的蘆丁對(duì)照品0.005 03 g，用75%乙醇溶解并定容至25 mL量瓶中。精密吸取0.5、1、2、2.5、4 mL，上述溶液置于10 mL具塞試管中，加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻；靜置6 min；再加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，最后加4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，加水至刻度，搖勻；靜置10 min，于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（y）、蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸，得方程y=6.254 1x-0.011 3（R2=0.999 6），表明蘆丁檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.036 98～0.148 9 mg/mL。

2.1.3 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液5 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法操作后測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果吸光度的RSD=1.06%（n=6），表明儀器精密度良好。分別取供試品溶液放置0、2、4、6、8、10、24 h后測(cè)定，結(jié)果總黃酮含量的RSD=2.38%（n=7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。按“2.1.1”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，照“2.1.2”項(xiàng)下方法操作后測(cè)定吸光度，結(jié)果吸光度的RSD=1.61%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。精密稱取已知含量的樣品粉末0.5 g，共6份，分別精密加入一定量的蘆丁對(duì)照品溶液（1 mg/mL），按“2.1.1”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按“2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算含量及回收率。結(jié)果，平均回收率為92.4%（RSD=2.35%，n=6），表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.1.4 總黃酮含量的測(cè)定 精密吸取各供試品溶液5 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品中總黃酮的含量（mg/g）。

2.2 當(dāng)歸根、莖中總黃酮提取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

筆者在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，回流提取總黃酮含量較超聲提取法高，故本試驗(yàn)采用回流提取法提取當(dāng)歸根、莖中總黃酮。以料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)為因素，考察各因素提取條件下的總黃酮含量。

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 精密稱取當(dāng)歸根、莖樣品粉末2.0 g，固定當(dāng)歸根、莖料液比為1 ∶ 30，于80 ℃恒溫水浴中回流提取1 h，考察不同體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%）的乙醇對(duì)當(dāng)歸根中總黃酮含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1A；同時(shí)，考察不同體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%、80%）的乙醇對(duì)當(dāng)歸莖中總黃酮含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2A。

由圖1A、圖2A可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，當(dāng)歸根、莖中總黃酮含量呈上升趨勢(shì)，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為80%、50%時(shí)總黃酮含量達(dá)到最高值，再增加乙醇體積分?jǐn)?shù)而總黃酮含量呈下降趨勢(shì)，確定當(dāng)歸根、莖中總黃酮提取時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)分別以80%、50%較優(yōu)。

2.2.2 料液比 精密稱取當(dāng)歸根、莖樣品粉末2.0 g，固定當(dāng)歸根、莖提取時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為80%、50%，于80 ℃恒溫水浴中回流提取1 h，考察不同料液比（根： 1 ∶ 20、1 ∶ 25、1 ∶ 30、1 ∶ 35、1 ∶ 40；莖：1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25、 1 ∶ 30、1 ∶ 35）對(duì)當(dāng)歸根、莖中總黃酮含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1B、圖2B。

由圖1B、圖2B可知，隨著料液比的增加，當(dāng)歸根、莖總黃酮含量呈上升趨勢(shì)，料液比分別為1 ∶ 35、1 ∶ 30時(shí)總黃酮含量達(dá)到最高值，再增加總黃酮含量變化微小，綜合考慮提取效率，確定當(dāng)歸根、莖料液比分別為1 ∶ 35、 1 ∶ 30。

2.2.3 提取時(shí)間 精密稱取當(dāng)歸根、莖樣品粉末2.0 g，固定當(dāng)歸根提取時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、料液比1 ∶ 35，當(dāng)歸莖提取時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、料液比1 ∶ 30；于80 ℃恒溫水浴中回流提取，考察不同提取時(shí)間（1、1.5、2、2.5、3 h）對(duì)當(dāng)歸根、莖總黃酮含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1C、圖2C。

由圖1C可知，隨著提取時(shí)間的增加，當(dāng)歸根總黃酮含量呈先下降后上升趨勢(shì)，2.5 h達(dá)最大值，且提取時(shí)間為1、2.5 h時(shí)總黃酮含量差別較小，綜合考慮提取效率，確定當(dāng)歸根提取時(shí)間為1 h。由圖2C可知，隨著提取時(shí)間的增加，當(dāng)歸莖總黃酮含量呈上升趨勢(shì)，1、1.5 h呈急劇上升趨勢(shì)，隨提取時(shí)間的增加上升趨勢(shì)變緩，總黃酮含量增長(zhǎng)幅度較小，綜合考慮提取效率，確定當(dāng)歸莖提取時(shí)間為1.5 h。

2.2.4 提取次數(shù) 精密稱取當(dāng)歸根、莖樣品粉末2.0 g，固定當(dāng)歸根提取時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、料液比1 ∶ 35，于80 ℃恒溫水浴中回流提取1 h；固定當(dāng)歸莖提取時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、料液比1 ∶ 30，于80 ℃恒溫水浴中回流提取1.5 h，考察不同提取次數(shù)（1、2、3、4次）對(duì)當(dāng)歸根、莖總黃酮含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1D、圖2D。

由圖1D可知，隨著提取次數(shù)的增加，當(dāng)歸根總黃酮含量呈上升趨勢(shì)，但隨提取次數(shù)的增加，總黃酮含量變化較小，為提高提取效率，確定當(dāng)歸根提取次數(shù)為1次。由圖2D可知，隨著提取次數(shù)的增加，當(dāng)歸莖總黃酮含量呈上升趨勢(shì)，提取2次時(shí)總黃酮含量急劇上升，繼續(xù)增加提取次數(shù)，總黃酮含量變化較小，綜合考慮，確定當(dāng)歸莖提取次數(shù)為2次。

2.3 當(dāng)歸根、莖中總黃酮提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box- Behnken設(shè)計(jì)原理，選取提取時(shí)間（X1）、料液比（X2）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X3）3個(gè)因素為自變量，以所得總黃酮含量為響應(yīng)值（Y），設(shè)計(jì)3因素5水平共20個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其中14個(gè)析因試驗(yàn)、6個(gè)中心試驗(yàn)，并綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果確定零水平和波動(dòng)區(qū)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1；設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.2 模型建立與顯著性分析 采用分析軟件 Design- Expert 8.0.5對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到多元二次回歸擬合方程如下：當(dāng)歸根為Y=6.63+0.046X1+0.57X2-0.30X3+0.078X1X2+0.095X1X3+8.5×10-3X2X3-0.083X12-0.31X22-0.93X32；當(dāng)歸莖為Y=25.16+0.16X1+1.22X2-0.51X3+0.1X1X2+0.30X1X3+0.087X2X3-0.22X12-0.82X22-1.03X32。方差分析結(jié)果分別見(jiàn)表3、表4。

由表3可知，該模型回歸（P=0.001 4<0.01）顯著，失擬項(xiàng)（P=0.067 2>0.05）不顯著，且該模型相關(guān)系數(shù)R2=0.881 6，說(shuō)明該模型與試驗(yàn)擬合良好，表明該模型擬合效果較好，可用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)回流提取當(dāng)歸根總黃酮的工藝條件。在各因素中，X2、X32極顯著，X22顯著，其余均不顯著；交互項(xiàng)無(wú)顯著影響。由F值大小可以判斷，在所選試驗(yàn)范圍內(nèi)，3 個(gè)因素的總黃酮含量影響排序?yàn)?X2>X3>X1。由表4結(jié)果可知，該模型回歸（P=0.000 8<0.01）顯著，失擬項(xiàng)（P=0.579 6>0.05）不顯著，且該模型R2=0.893 5，表明該模型擬合效果較好，可用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)回流提取當(dāng)歸莖總黃酮的工藝條件。在各因素中，X2、X22、X32高度顯著，X3顯著，其余均不顯著；交互項(xiàng)無(wú)顯著影響。由F值大小可以判斷，在所選試驗(yàn)范圍內(nèi)，3個(gè)因素的總黃酮含量影響排序?yàn)閄2>X3>X1。

2.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)擬合模型繪制當(dāng)歸根、莖中總黃酮的響應(yīng)面圖，判斷最優(yōu)參數(shù)及各參數(shù)之間的交互作用，以此確定最優(yōu)工藝參數(shù)范圍，詳見(jiàn)圖3、圖4。

（1）X1-X2。由圖3A可知，當(dāng)X3值一定、X2值不變時(shí)，Y值隨著X1的增加變化較小，曲線較為平坦；X1值不變時(shí)，Y值隨著X2值的增加而增加，到達(dá)一定程度后，隨著X2值的增加變化緩慢。當(dāng)料液比為1 ∶ 30～1 ∶ 40時(shí)，總黃酮含量最高且?guī)缀醪蛔?。由圖4A可知，當(dāng)X3值一定、X2值不變時(shí)，Y值隨著X1值的增加變化不大，曲線較為平坦；X1值不變時(shí)，Y值隨著X2值的增加而增加，到達(dá)一定程度后，隨著數(shù)值的增加變化緩慢。當(dāng)X2值為1 ∶ 25～ 1 ∶ 35時(shí)，Y值最高且?guī)缀醪蛔儭?/p>

（2）X1-X3。由圖3B可知，當(dāng)X2值一定時(shí)、X3值不變時(shí)，Y值隨著X1值的增加變化較小，曲線較為平坦；當(dāng)X1值不變時(shí)，Y值隨著X3值的增加而增加，到達(dá)一定程度后，隨著X3值的增加反而下降。當(dāng)X2值在58%～74%時(shí)，Y值最高且?guī)缀醪蛔?。根?jù)相似相溶原理可知，當(dāng)歸根總黃酮極性與此范圍體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液的極性相當(dāng)。由圖4B可知，當(dāng)X2值一定、X3值不變時(shí)，Y值隨著X1值的增加變化不大，曲線較為平坦；當(dāng)X1值不變時(shí)，Y值隨著X3值的增加而增加，到達(dá)一定程度后，隨著X3值的增加反而下降。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在45%～55%時(shí)，Y值最高且?guī)缀醪蛔?。根?jù)相似相溶原理可知，當(dāng)歸莖總黃酮極性與此范圍體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液的極性相當(dāng)。

（3）X2-X3。結(jié)果見(jiàn)圖3C、圖4C。由圖3C、圖4C可知，當(dāng)X1值一定時(shí)，Y值隨X2值及X3值的增大均呈先增大后減小的趨勢(shì)，并從圖形走向趨勢(shì)看，X2值的影響效應(yīng)更大。三者的交互作用與回歸方差分析結(jié)果一致。

從響應(yīng)面圖可以判斷出最佳點(diǎn)均落在試驗(yàn)考察區(qū)域內(nèi)，根據(jù)所得到的模型，回流提取當(dāng)歸根、莖總黃酮最優(yōu)提取條件分別為乙醇體積分?jǐn)?shù)67.53%、48.50%，料液比1 ∶ 39.9、1 ∶ 32.69，回流時(shí)間1.34、1.67 h?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將當(dāng)歸根、莖總黃酮的提取工藝條件分別修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、50%，料液比1 ∶ 40、1 ∶ 30，回流時(shí)間1.3、1.7 h。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

分別精密稱取3份當(dāng)歸根、莖樣品各100.0 g，按上述修正的最優(yōu)提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，操作方法同前。結(jié)果，當(dāng)歸根提取液的總黃酮含量為7.253 6 mg/g（RSD=1.57%，n=3），與理論預(yù)測(cè)值6.942 8 mg/g基本吻合（相對(duì)誤差為4.28%）。當(dāng)歸莖提取液的總黃酮含量為25.144 1 mg/g（RSD=1.49%，n=3），與理論預(yù)測(cè)值25.703 5 mg/g基本吻合（相對(duì)誤差為2.24%）。

3 討論

在試驗(yàn)前期，筆者曾采用80%乙醇提取當(dāng)歸莖中總黃酮，結(jié)果提取液呈綠色，采用對(duì)提取液離心、活性炭吸附、石油醚萃取及石油醚索氏回流提取等方法去除葉綠素，效果均不理想。但在后續(xù)單因素試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%時(shí)當(dāng)歸莖總黃酮含量較高，且提取液為棕黃色，全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)無(wú)葉綠素吸收峰，推測(cè)在此乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下葉綠素對(duì)總黃酮提取液影響較小。故確定提取當(dāng)歸總黃酮時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)最低為50%，且由此簡(jiǎn)化了試驗(yàn)步驟。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)歸根總黃酮乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，而當(dāng)歸莖乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，由此可推斷當(dāng)歸根中黃酮極性較小，而當(dāng)歸莖中黃酮極性較大。

目前，對(duì)當(dāng)歸地上部分莖總黃酮提取工藝的研究文獻(xiàn)報(bào)道較少。Ben-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法相對(duì)于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)法具有預(yù)測(cè)性好、精確度高的特點(diǎn)，故本課題組采用單因素試驗(yàn)與Ben-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法相結(jié)合對(duì)當(dāng)歸根、莖總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差較小，表明采用響應(yīng)面法所得優(yōu)化條件穩(wěn)定、可靠。另外，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸莖中總黃酮含量約為根中總黃酮的3.24倍。故筆者認(rèn)為應(yīng)將當(dāng)歸地上部分特別是莖部合理開(kāi)發(fā)利用，在避免資源浪費(fèi)的同時(shí)可增加經(jīng)濟(jì)效益，由此還可提高當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)生產(chǎn)積極性。本研究結(jié)果為當(dāng)歸地上部分莖的開(kāi)發(fā)利用提供了參考依據(jù)。

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（收稿日期：2017-06-01 修回日期：2017-07-10）

（編輯：劉 萍）