正交試驗(yàn)—多指標(biāo)歸一化法優(yōu)化鳳丹皮水提工藝

王培　趙宏蘇　吳德玲　許鳳清　張偉　龍全江　方成武

中圖分類號(hào) R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）03-0361-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.03.17

摘 要 目的：優(yōu)化鳳丹皮水提工藝。方法：采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以鳳丹皮中8個(gè)成分沒食子酸、氧化芍藥苷、兒茶素、芍藥苷、苯甲酸、苯甲酰氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、丹皮酚的峰面積百分比和浸膏率經(jīng)歸一化法后的綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，對(duì)鳳丹皮水提工藝的藥材浸泡時(shí)間、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果：最優(yōu)水提工藝為加20倍水，浸泡藥材1 h，提取2次、每次2 h。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果中，3次試驗(yàn)的綜合評(píng)分分別為65.98、68.85、69.25，各指標(biāo)的RSD均小于5%（n=3）。結(jié)論：建立的綜合評(píng)分方法能較全面地反映鳳丹皮的相對(duì)有效成分含量，以此優(yōu)化得到的提取工藝合理、可行。

關(guān)鍵詞 鳳丹皮；多指標(biāo)；歸一化法；正交試驗(yàn)；提取工藝；優(yōu)化

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize water extraction technology of Feng-Moutan Cortex. METHODS： L9（34） orthogonal design was used to optimize soaking time， solid-liquid ratio， extraction time and extraction times in water extraction technology of Feng-Moutan Cortex using comprehensive scores for the peak area percentage and extract yield of 8 ingredients in Feng-Moutan Cortex as gallic acid， paeoniflorin， catechin， paeoniflorin， benzoic acid， benzoyloxypaeoniflorin， benzoylpaeoniflorin and paeonol after normalization as indexes. Verification test was conducted. RESULTS： The optimal water extraction technology was that 20-fold water， soaking for 1 h， extracting twice， 2 h each time. Results of verification test showed that comprehensive scores of 3 times of tests were 65.98， 68.85 and 69.25， respectively. RSDs of each index were lower than 5% （n=3）. CONCLUSIONS： Established comprehensive scoring method can reflect the relative contents of effective components in Feng-Moutan Cortex comprehen- sively， so that optimized extraction technology is reasonable and feasible.

KEYWORDS Feng-Moutan Cortex； Multiple-index； Normalization method； Orthogonal test； Extraction technology； Optimization

牡丹皮為毛茛科植物牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）的干燥根皮，具有清熱涼血、活血化瘀之功效，主要用于溫毒發(fā)斑、吐血、夜熱早涼、無汗骨蒸、經(jīng)閉痛經(jīng)等癥狀[1]。牡丹皮在我國主要分布于安徽銅陵、南陵、亳州、青陽，重慶墊江，甘肅榆中以及四川、山東、陜西、湖南等地。傳統(tǒng)認(rèn)為銅陵鳳凰山、南陵丫山為丹皮的道地產(chǎn)區(qū)，該產(chǎn)區(qū)牡丹皮被稱為鳳丹皮[2]。本研究以道地藥材鳳丹皮為研究對(duì)象，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)鳳丹皮水提工藝，選定沒食子酸、氧化芍藥苷、兒茶素、芍藥苷、苯甲酸、苯甲酰氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、丹皮酚等8個(gè)成分的面積百分比和浸膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)[3]，采用峰面積歸一化法對(duì)多指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，篩選最優(yōu)水提工藝。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色譜系統(tǒng)，包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Empower3 色譜工作站（美國Waters公司）；PALL Cascada II.I超純水一體化系統(tǒng)[頗爾過濾器（北京）有限公司]；WL-100打粉機(jī)（瑞安市威力制藥機(jī)械廠）；EX125DZHW十萬分之一天平（美國奧豪斯儀器有限公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海光都儀器設(shè)備有限公司）；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司）。

1.2 藥材、對(duì)照品與試劑

鳳丹皮于2016年10月采自銅陵鳳凰山，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉守金教授鑒定為毛茛科植物4年生牡丹的根皮；沒食子酸（批號(hào)：GZDD-0128）、兒茶素（批號(hào)：GZDD-0073）、芍藥苷（批號(hào)：0736-200015）、苯甲酰氧化芍藥苷（批號(hào)：GZDD-1655）、苯甲酸（批號(hào)：GZDD- 0182）、苯甲酰芍藥苷（批號(hào)：GZDD-0758）對(duì)照品均購于貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司，純度均大于98%；氧化芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：16021505，純度：99.93%）由北京恒元啟天化工技術(shù)研究所提供；丹皮酚對(duì)照品（安徽中醫(yī)藥大學(xué)天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室制，批號(hào)：2016-11，純度：>99%，經(jīng)峰面積歸一化法計(jì)算）；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材的前處理

鳳丹皮藥材采集后清洗去除泥沙，除去細(xì)根，剝?nèi)「?，曬干，?8 ℃以下干燥[4]，粉碎，過4號(hào)篩備用。

2.2 多成分峰面積百分比測定方法的建立

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定各對(duì)照品沒食子酸4.02 mg、氧化芍藥苷5.05 mg、兒茶素1.47 mg、芍藥苷5.53 mg、苯甲酸2.93 mg、苯甲酰氧化芍藥苷1.76 mg、苯甲酰芍藥苷1.01 mg、丹皮酚2.47 mg，分別加入50%甲醇溶解，定容至10 mL量瓶中，制成對(duì)照品貯備液。精密吸取各對(duì)照品貯備液適量，置于10 mL量瓶中，制成上述8種成分質(zhì)量濃度分別為40.2、50.5、28.4、110.6、58.6、35.2、22.0、123.5 ?g/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取鳳丹皮藥材粉末10 g，精密稱定9份，根據(jù)正交試驗(yàn)進(jìn)行回流提取，每次提取后過濾，合并濾液，定容至100 mL量瓶中。吸取5 mL，用甲醇定容至25 mL量瓶中，搖勻，用0.22 ?m微孔濾膜濾過，即得各提取液的供試品溶液。另量取提取液50 mL經(jīng)濃縮后真空干燥至恒質(zhì)量，稱取浸膏量，供測定浸膏率用。

2.2.3 色譜條件 色譜柱：Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相：乙腈（A）-0.02%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～1 min，8～15%A；1～8 min，15%～18%A；8～10 min，18%～30%A；10～15 min，30%～35%A；15～20 min，35%～85%A）；流速：0.15 mL/min；進(jìn)樣體積：2 μL；柱溫：30 ℃；檢測波長：230 nm。按上述色譜條件，取“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和供試品溶液（正交試驗(yàn)中7號(hào)）進(jìn)樣分析，結(jié)果各成分色譜峰及與相鄰峰間的分離度均大于1.5。色譜圖見圖1。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取鳳丹皮10 g，精密稱定。按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果，各成分峰面積的RSD均小于2.75%（n=6），表明本試驗(yàn)精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批鳳丹皮藥材6份，每份10 g。按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，各成分峰面積的RSD均小于3.03%（n=6），表明本試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（正交試驗(yàn)7號(hào)），分別在放置0、2、4、8、10、12、24 h進(jìn)樣測定。結(jié)果，各成分峰面積的RSD均小于2.33%（n=7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 正交試驗(yàn)鳳丹皮優(yōu)化水提工藝

2.3.1 因素與水平 采用L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)鳳丹皮水提工藝進(jìn)行優(yōu)化[5-6]。經(jīng)前期預(yù)試驗(yàn)后，選擇水提工藝的4個(gè)影響因素：藥材浸泡時(shí)間（A，h）、料液比（B，g/mL）、提取時(shí)間（C，h）及提取次數(shù)（D）進(jìn)行考察，建立4因素3水平表，詳見表1。

2.3.2 指標(biāo)計(jì)算 將8個(gè)成分峰面積百分比（各成分峰面積占有效成分總峰面積的百分比）的權(quán)重系數(shù)分別設(shè)定為10，浸膏率權(quán)重系數(shù)設(shè)定為20，各項(xiàng)指標(biāo)通過百分制評(píng)價(jià)[7-8]，歸一化處理后，得到綜合評(píng)分（Pj）。歸一化方程[9]為：Rij=（Fij-Fimin）/（Fimax-Fimin）。式中，Rij為第i個(gè)指標(biāo)、第j次試驗(yàn)的峰面積百分比歸一化值；Fij為第i個(gè)指標(biāo)、第j次試驗(yàn)峰面積百分比；Fimax、Fimin 為第i個(gè)指標(biāo)峰面積百分比的最大值和最小值；i為評(píng)價(jià)指標(biāo)，i=1、2、3…… 8，j為試驗(yàn)次數(shù)，j=1、2、3……9。Ej=（Nj-Njmin）/（Njmax-Njmin），式中Ej為浸膏率的歸一化值，Nj表示第j次試驗(yàn)中的浸膏率。Pj=10× [∑][i=1][j=8]Rij+20×Ej。

2.3.3 試驗(yàn)方案與結(jié)果 選擇L9（34）正交試驗(yàn)，采用多指標(biāo)歸一化-加權(quán)法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，各試驗(yàn)中8個(gè)成分峰面積百分比及浸膏率測定結(jié)果見表2，正交試驗(yàn)方案及綜合評(píng)分結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

由表3、表4可見，各因素影響大小依次為B>C>A>D，即料液比>提取時(shí)間>藥材浸泡時(shí)間>提取次數(shù)。方差分析結(jié)果顯示，料液比在鳳丹皮提取過程中有顯著影響。由結(jié)果來看，雖以A2B2C3D3為最優(yōu)組合，但D因素的第2、3水平之間的差距較小，即增加提取次數(shù)也不會(huì)大幅度地提高指標(biāo)得分，反而只會(huì)增加能耗、浪費(fèi)時(shí)間，故從經(jīng)濟(jì)環(huán)保、節(jié)約成本的方面考慮，最終確定鳳丹皮的最優(yōu)水提工藝為A2B2C3D2，即藥材浸泡1 h，加入20倍體積的水，提取2次、每次2 h。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取鳳丹皮藥材3份，每份精密稱定100 g，置于圓底燒瓶中，加入2 L純水，浸泡1 h，加熱回流提取2次，每次2 h。結(jié)果，3次試驗(yàn)8個(gè)成分峰面積百分比及浸膏率的RSD均小于5%（n=3），表明優(yōu)化的水提工藝可行、穩(wěn)定，結(jié)果見表5。

3 討論

鳳丹皮中含有多種化學(xué)成分，其主要化學(xué)成分為酚及酚苷類、單萜及其苷類、有機(jī)酸類、黃酮類等[10-11]。其中丹皮酚屬于酚及酚苷類，芍藥苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、苯甲酰氧化芍藥苷屬于單萜及其苷類，沒食子酸、苯甲酸屬于有機(jī)酸類，兒茶素屬于黃酮類。藥理研究發(fā)現(xiàn)：酚及酚苷類中的丹皮酚具有降血糖、抗炎、抗過敏及免疫調(diào)節(jié)等作用，單萜及其苷類中的芍藥苷具有抗血小板聚集、降血壓、調(diào)節(jié)血脂、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗炎等作用。有機(jī)酸類成分具有抗炎、抑制血小板聚集、抗氧化等作用[12-13]，黃酮類成分具有抑制酪氨酸酶、高級(jí)糖化物終末產(chǎn)物（AGES）的產(chǎn)生等作用[14]。目前在牡丹皮提取工藝研究中，有的選取丹皮總酚作為指標(biāo)性成分，有的選取總苷單體作為指標(biāo)性成分，有的選取總黃酮作為指標(biāo)性成分等[15-17]。以上試驗(yàn)中提取工藝的優(yōu)化在指標(biāo)選擇上都存在一定局限性，故筆者將具有明確藥理活性的酚及酚苷類成分、單萜及其苷類成分、有機(jī)酸類成分、黃酮類成分同時(shí)作為優(yōu)選鳳丹皮提取工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)，并結(jié)合浸膏率，可在一定程度上保證鳳丹皮提取工藝的合理性，并且能夠較全面地反映藥材的質(zhì)量，使其在臨床使用時(shí)具有更好的藥物作用效果。

本試驗(yàn)以鳳丹皮中8個(gè)活性成分和浸膏率為考察指標(biāo)，優(yōu)化水提工藝，有利于兼顧各指標(biāo)的綜合效應(yīng)，符合中藥化學(xué)成分復(fù)雜的特點(diǎn)。同時(shí)為減少8個(gè)成分含量測定工作的煩瑣，運(yùn)用多指標(biāo)歸一化法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并建立了正交試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)公式。本試驗(yàn)建立的提取工藝方法簡單、快速，可為中藥有效成分的提取評(píng)價(jià)提供一定的參考。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S]. 2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：172.

[ 2 ] 侯宇榮，劉煒，鄭艷.安徽南陵丫山產(chǎn)牡丹皮的道地性研究[J].中藥材，2014，37（8）：1488-1491.

[ 3 ] 范旭航，馬天成，沈旭，等. UPLC 法測定不同產(chǎn)地不同部位牡丹皮中6種活性成分[J].中成藥，2012，34（2）：317-320.

[ 4 ] 胡云飛，徐倩，徐國兵，等.牡丹皮炒制前后 UPLC 特征指紋圖譜比較[J].中國藥房，2015，26（6）：800-802.

[ 5 ] 王立，侯世祥，胡平，等.牡丹皮藥材的最適提取工藝研究[J].中國中藥雜志，2005， 30（8）：569-571.

[ 6 ] 孟慶煥，祖元?jiǎng)偅趸?，?牡丹種皮中芍藥苷和丹皮酚的優(yōu)化提取工藝[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（17）：68-71.

[ 7 ] 鄭禮娟，秦昆明，蔡皓，等.多指標(biāo)正交試驗(yàn)優(yōu)選白術(shù)芍藥散提取工藝[J].中國中藥雜志，2013，38（10）：1504-1509.

[ 8 ] 張星海，李嬛，秦昆明，等.多指標(biāo)正交試驗(yàn)優(yōu)化菊花提取工藝[J].中國中藥雜志，2013，38（6）：821-824.

[ 9 ] 梁苗苗，林強(qiáng)，王洋.運(yùn)用多指標(biāo)數(shù)據(jù)歸一化加權(quán)法綜合評(píng)價(jià)我國護(hù)理期刊的學(xué)術(shù)影響力[J].護(hù)理學(xué)雜志，2011，26（21）：88-90.

[10] 曹春泉.牡丹皮的化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].廣州化工，2013，41（12）：44-45.

[11] 范旭航，馬天成，沈旭，等. UPLC 法測定不同產(chǎn)地不同部位牡丹皮中 6 種活性成分[J].中成藥，2012，34（2）：317-320.

[12] 王祝舉，唐力英，赫炎.牡丹皮的化學(xué)成分和藥理作用[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2006，21（4）：155-159.

[13] 湯喜蘭，劉建勛，李磊.中藥有機(jī)酸類成分的藥理作用及在心血管疾病的應(yīng)用[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（5）：243-246.

[14] DING HY，LIN HC，CHANG TS. Tyrosinase inhibitors isolated from the roots of Paeonia suffruticosa[J]. Int J Cosmetic Sci，2010，32（2）：162-162.

[15] 徐金龍，張紅梅，徐秀泉.響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化牡丹皮中總酚的提取工藝[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（34）：19295- 19297.

[16] 王艷華，吳德玲，劉勁松，等.牡丹皮中丹皮總苷的提取工藝研究[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，31（2）：69-71.

[17] 徐金龍，張紅梅，徐秀泉.響應(yīng)面分析法優(yōu)化牡丹皮中總黃酮的提取工藝[J].中國藥房，2011，22（27）：2536-2538.

（收稿日期：2017-06-07 修回日期：2017-11-06）

（編輯：劉 萍）