補(bǔ)腎養(yǎng)血顆粒的提取工藝優(yōu)化研究

劉霞　楊敏　冷靜　范智琴　徐沖

中圖分類號 R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）03-0349-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.03.14

摘 要 目的：優(yōu)化補(bǔ)腎養(yǎng)血顆粒的提取工藝，為其開發(fā)成醫(yī)院制劑提供依據(jù)。方法：以金絲桃苷含量、總黃酮含量和出膏率的綜合評分為評價(jià)指標(biāo)，以加水量、提取時(shí)間和提取次數(shù)為考察因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化補(bǔ)腎養(yǎng)血顆粒的提取工藝并進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：補(bǔ)腎養(yǎng)血顆粒最優(yōu)提取工藝為每次加水10倍量，提取2次，每次1 h。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，金絲桃苷、總黃酮含量分別為0.154、11.094 mg/g（RSD=0.010%、0.008%，n=3）；出膏率均值為37.76%（RSD=0.008%，n=3）。結(jié)論：優(yōu)化后的提取工藝穩(wěn)定、可行，可為補(bǔ)腎養(yǎng)血顆粒的制劑開發(fā)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 補(bǔ)腎養(yǎng)血顆粒；提取工藝；金絲桃苷；總黃酮；正交試驗(yàn)

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize the extraction technology of Bushen yangxue granules， and to provide reference for developing hospital preparations. METHODS： The orthogonal test was designed to optimize the extraction technology of Bushen yangxue granules using the comprehensive score including the content of hyperoside and total flavonoids， extract yield as evaluation indexes， water amount， extraction time and extraction times as factors. Verification test was also conducted. RESULTS： The extraction technology of Bushen yangxue granules was 10-fold water， extracting for 2 times and 1 hour each time. The results of verification test indicated that the contents of hyperoside and total flavonoids were 0.154 mg/g （RSD=0.010%， n=3） and 11.094 mg/g（RSD=0.008%， n=3）. The average extract yield was 37.76% （RSD=0.008%，n=3）. CONCLUSIONS： The optimized extraction technology is stable and feasible， which can provide the basis for developing hospital preparations of Bushen yangxue granules.

KEYWORDS Bushen yangxue granules； Extraction technology； Hyperoside； Total flavonoids； Orthogonal test

補(bǔ)腎養(yǎng)血顆粒系由我院主任中醫(yī)師朱光德創(chuàng)立的經(jīng)驗(yàn)方——“補(bǔ)腎養(yǎng)血方”制作而來，朱光德致力于脫發(fā)病的研究，在“發(fā)為血之余”的基礎(chǔ)上，發(fā)展出“腎虧血虛，濕熱熏蒸”的理論，并以該理論為指導(dǎo)，形成此方。全方由制首烏、熟地黃、菟絲子、桑椹、枸杞子、制黃精、丹參等19味藥組成，具有補(bǔ)腎養(yǎng)血、烏發(fā)生發(fā)、填精補(bǔ)腦之功效，主要用于肝腎不足、氣血兩虛或脾虛生濕所致脫發(fā)，癥見毛發(fā)松動或呈稀疏狀脫落、毛發(fā)干燥或油膩、頭皮瘙癢；斑禿，早禿，脂溢性脫發(fā)與病后、產(chǎn)后脫發(fā)見上述證候者。該方經(jīng)過十幾年臨床應(yīng)用，療效顯著、安全可靠[1-2]，現(xiàn)擬開發(fā)成醫(yī)院制劑。本研究采用正交試驗(yàn)法，以提取物中金絲桃苷含量、總黃酮含量[3-4]和出膏率為綜合評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化補(bǔ)腎養(yǎng)血顆粒的提取工藝條件，為其開發(fā)成醫(yī)院制劑提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜（HPLC）儀（美國Agilent公司）；UV-2450紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；XA205DU精密電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；AS10200AT超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 藥材、對照品與試劑

制首烏、熟地黃、菟絲子、當(dāng)歸、紅參、丹參、赤芍、制黃精、陳皮、苦參、茯苓、桑椹、枸杞子、防風(fēng)、蒼術(shù)、川芎、天麻、黑芝麻、核桃仁飲片均購自重慶中藥飲片廠有限公司，批號分別為：1410035、1501049、1501007、1502041、1411056、1412126、1411113、1501047、1501020、1502022、1501079、15020101、14010132、15020128、15010106、14080113、15080142、15080122、15060202，經(jīng)我院藥檢室陳玲副主任中藥師鑒定為真品；金絲桃苷對照品、蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111521、0080-9504，純度：>94.3%、>98%）；乙腈、磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 出膏率的測定

稱取處方量的飲片，加入一定量的水進(jìn)行提取，計(jì)量體積，備用。精密量取提取液250 mL，按2015年版《中國藥典》（四部）通則0831干燥失重測定法項(xiàng)下[5]方法測定出膏量，計(jì)算出膏率（出膏量/處方量×100%）。

2.2 金絲桃苷含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液 （17 ∶ 83，V/V）[6]；二極管陣列檢測器，檢測波長：360 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取金絲桃苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.121 7 mg的金絲桃苷對照品溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 取提取后的浸膏約5 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加80%甲醇50 mL，超聲處理（240 W，45 kHz）1 h，放冷，加80%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液制備 按補(bǔ)腎養(yǎng)血顆粒水提處方的提取制備工藝制得缺菟絲子的陰性樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下操作方法制得陰性樣品溶液。

2.2.5 專屬性考察 取上述3種溶液（其中供試品溶液為正交試驗(yàn)9號樣品），進(jìn)樣測定。結(jié)果，所測成分色譜峰與樣品中其他組分色譜峰基線分離，且陰性樣品無干擾，色譜見圖1。

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取金絲桃苷“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液5 mL至50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。再分別精密吸取0.5、1.0、1.5、2.5、3.0 mL至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，進(jìn)樣測定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x，ng）、峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=59.653x-15.592（r=0.999 5），結(jié)果表明金絲桃苷進(jìn)樣量線性范圍為24.34～146.04 ng。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取金絲桃苷對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測得金絲桃苷峰面積的RSD=0.62%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一份樣品6份，每份約5 g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定。測得金絲桃苷峰面積的RSD=1.65%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，分別于放置0、2、4、6、8 h進(jìn)樣測定，計(jì)算得金絲桃苷峰面積的RSD=1.82%（n=5），表明供試品溶液8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.10 準(zhǔn)確度考察 采用加樣回收法。取已知含量的浸膏9份，每份含金絲桃苷4.86 μg/g，精密稱定，分別置于50 mL具塞三角瓶中，分成3組，每組3份，每組分別添加金絲桃苷對照品溶液（24.34 μg/mL）1.4、1.8、2.0 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，金絲桃苷的平均加樣回收率為97.50%（RSD=2.0%，n=9），表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.3 總黃酮含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品，精密稱定，加30%乙醇制成每1 mL含蘆丁0.313 2 mg的溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 取浸膏約5 g，精密稱定，加60%乙醇100 mL，超聲處理（240 W，45 kHz）1 h，放冷，濾過；濾液用60%乙醇定容至100 mL量瓶中，搖勻。精密量取25 mL，置于50 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻作為供試品溶液。

2.3.3 波長的選擇 精密量取對照品溶液3 mL和供試品溶液6 mL，分別置于25 mL量瓶中，加30%乙醇至6.0 mL，參考文獻(xiàn)[6]方法顯色，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉溶液10 mL，再加30%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，以紫外-可見分光光度法于400～700 nm波長間掃描。

結(jié)果，供試品溶液與蘆丁對照品溶液顯色后吸收圖譜基本一致，在509 nm波長處均有最大吸收，因此，選509 nm為測定供試品總黃酮含量的波長。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密量取對照品溶液0.5、1、2、2.5、5、5.5 mL，分別置于25 mL量瓶中，各加30%乙醇至6.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min。加氫氧化鈉試液10 mL，再加30%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，采用紫外-可見分光光度法，在509 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（y）、進(jìn)樣量（x，mg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照最小二乘法進(jìn)行回歸，得回歸方程y=0.449 3x+0.004（r=0.999 7）。結(jié)果表明，總黃酮進(jìn)樣量線性范圍為0.156 6～1.722 6 mg。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取蘆丁對照品溶液（0.313 2 mg/mL）2.0 mL，共6份，分別置于25 mL量瓶中，參照“2.3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色，509 nm波長下測定吸光度。結(jié)果，吸光度的RSD=1.61%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取浸膏（正交試驗(yàn)9號）按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于放置0、10、20、30、40、50、60 min后測定吸光度。結(jié)果，吸光度的RSD=1.52%（n=7），表明供試品溶液60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批浸膏（正交試驗(yàn)9號），按“2.3.2”項(xiàng)下方法分別制備6份供試品溶液，測定總黃酮吸光度。結(jié)果，吸光度的RSD=1.56%（n=6），表明本方法重復(fù)性好。

2.3.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精密稱取浸膏3份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每份樣品分別取3份，每份3 mL置于25 mL量瓶中，再分別精密加入蘆丁對照品溶液（0.313 2 mg/mL）1.5、2.0、2.5 mL，加30%乙醇至6.0 mL，509 nm波長下測定總黃酮的量，計(jì)算回收率。結(jié)果，加樣回收率為104.43%～109.57%，平均加樣回收率為106.49%（RSD<2%，n=9），符合含量測定要求。

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

稱取補(bǔ)腎養(yǎng)血顆粒處方102 g，根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確定以加水量（A）、提取時(shí)間（即煎煮時(shí)間，B）、提取次數(shù)（C）為考察因素，每因素取3個水平，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，以提取物中金絲桃苷的含量、總黃酮含量和出膏率的綜合評分為評價(jià)指標(biāo)，綜合評分=（金絲桃苷含量/金絲桃苷含量最大值×0.4+總黃酮含量/總黃酮含量最大值×0.4+出膏率/出膏率最大值×0.2）×100。因素與水平見表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2（注：表中含量是以浸膏量中的含量計(jì)），方差分析結(jié)果見表3。

由表2直觀分析可知，A3>A1>A2，B3>B2>B1，C3>C2>C1，影響提取效果的順序?yàn)椋禾崛〈螖?shù)（C）>加水量（A）>提取時(shí)間（B），最優(yōu)工藝為：A3B3C3。表3方差分析結(jié)果表明，因素A、B、C對提取結(jié)果有顯著影響，綜合考慮生產(chǎn)效率和節(jié)能等各方面的因素，確定優(yōu)選工藝為A3B2C2，即每次加水10倍量，提取2次，每次1 h。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證上述優(yōu)化工藝的可行性，進(jìn)行3批10倍處方量的放大試驗(yàn)，按最優(yōu)工藝條件提取，測定金絲桃苷、總黃酮含量和出膏率；再計(jì)算金絲桃苷轉(zhuǎn)移率（浸膏中含

金絲桃苷總量/菟絲子藥材中含金絲桃苷總量×100%）。結(jié)果，金絲桃苷、總黃酮含量和出膏率分別為0.154、11.094 mg/g和37.76%（RSD=0.010%、0.008%、0.008%，n=3），表明本研究所確定的提取工藝效率較高，穩(wěn)定可行，詳見表4。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為脫發(fā)證見多端，但根據(jù)臟腑理論，脫發(fā)的病因仍以肝腎不足為本，血瘀、血熱、濕熱為標(biāo)。然而本病多為虛實(shí)夾雜或本虛標(biāo)實(shí)證，隨著社會發(fā)展、工作節(jié)奏、生活方式等外部環(huán)境的變化，脫發(fā)不僅僅是由虛而致，更是由于精神壓力的增加以及飲食的失衡所導(dǎo)致的一種虛實(shí)夾雜的脫發(fā)病癥[1]。

本方治療脫發(fā)，便是基于“腎虧血虛，濕熱熏蒸”的理論，從氣、血、肝、腎、心、脾入手，養(yǎng)血生發(fā)貫穿始終，既養(yǎng)肝腎之陰，以生陰血；亦補(bǔ)后天脾胃，使氣血生化有源[1]。

全方共19味藥材，其中3味貴細(xì)藥材（紅參、天麻、茯苓）制粒時(shí)直接粉碎入藥，采用煎煮有16味，其中的12味藥（制首烏、熟地黃、菟絲子、桑葚、陳皮、枸杞子、當(dāng)歸、川芎、黃精、丹參、芝麻、核桃仁）含黃酮[7-17]。文獻(xiàn)報(bào)道，黃酮類化合物對心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等均有調(diào)節(jié)作用[18-23]。其抗氧化和清除自由基作用可改善細(xì)胞相關(guān)功能，促進(jìn)組織正常功能的恢復(fù)；黃酮類化合物，特別是異黃酮，化學(xué)結(jié)構(gòu)與雌激素相似，能夠?qū)θ梭w內(nèi)分泌進(jìn)行調(diào)節(jié)；黃酮類成分可促進(jìn)血液循環(huán)，激活毛母細(xì)胞，使毛發(fā)生長能力衰退的毛囊復(fù)活，補(bǔ)充營養(yǎng)成分，從而發(fā)揮養(yǎng)發(fā)生發(fā)的作用[24-25]；此外，黃酮類化合物可抗抑郁、延緩衰老[26]，從而在一定程度上可緩和因工作節(jié)奏、生活方式等外部環(huán)境的變化引起的精神壓力增加以及飲食的失衡所導(dǎo)致的脫發(fā)。

因此，課題組選取總黃酮為檢測指標(biāo)之一，然而此方藥味眾多，無法準(zhǔn)確測得總黃酮轉(zhuǎn)移率，不能很好地評價(jià)提取工藝的適用性和可靠性，故另外選取同為黃酮類成分的金絲桃苷（臣藥菟絲子的有效成分）作為評價(jià)指標(biāo)二，用以計(jì)算轉(zhuǎn)移率；二者結(jié)合評價(jià)提取工藝更具實(shí)際意義。

最優(yōu)提取工藝經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，出膏率、金絲桃苷轉(zhuǎn)移率均較高，表明所確定的提取工藝條件可行，可用于進(jìn)一步的制劑生產(chǎn)。

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（收稿日期：2017-05-22 修回日期：2017-07-25）

（編輯：劉 萍）