川貝母對哮喘模型小鼠氣道炎癥及ERK/MAPK信號通路的影響

張羽飛　徐紅納　黃偉　任公平　李厚忠

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）03-0343-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.03.13

摘 要 目的：考察川貝母對哮喘模型小鼠氣道炎癥及細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）/絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路的影響，探討其治療哮喘的可能機制。方法：以卵蛋白致敏小鼠建立哮喘模型。將造模成功的40只小鼠隨機分為模型組（灌胃0.5%羧甲基纖維素）、陽性對照組（腹腔注射0.5 mg/kg地塞米松）和川貝母低、高劑量組（灌胃9.0、18.0 mg/kg），每組10只；另選10只正常小鼠作為正常組（灌胃0.5%羧甲基纖維素）。每天給藥1次，連續(xù)28 d。給藥結(jié)束后，對小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中總細胞和分類細胞（中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞）進行計數(shù)；光鏡下觀察小鼠支氣管平滑肌病理組織形態(tài)，并進行炎癥評分；酶聯(lián)免疫吸附法測定肺組織中ERK、磷酸化ERK（p-ERK），p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）活性；Western blot法測定肺組織中ERK、p-ERK、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表達；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)法測定肺組織中ERK、 p38 MAPK mRNA表達。結(jié)果：與正常組比較，模型組小鼠BALF中總細胞計數(shù)、分類細胞計數(shù)、炎癥評分和肺組織中p-ERK、p-p38 MAPK活性均顯著升高（P<0.01），肺組織中p-ERK、p-p38 MAPK蛋白表達以及ERK、p38 MAPK mRNA表達均顯著增強（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠上述指標均顯著改善（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：川貝母可改善哮喘模型小鼠氣道炎癥，其機制可能與抑制ERK/MAPK信號通路的激活有關(guān)。

關(guān)鍵詞 川貝母；哮喘；氣道炎癥；細胞外信號調(diào)節(jié)激酶/絲裂原活化蛋白激酶信號通路；小鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of Fritillariae cirrhosae bulbus on airway inflammation and ERK/MAPK signal pathway of asthma model mice， and to explore its possible mechanism of the treatment of asthma. METHODS： The asthma model was induced by egg albumin. A total of 40 model mice were randomly divided into model group （0.5% carboxymethyl cellulose， intragastric administration）， positive control group （0.5 mg/kg dexamethasone， intraperitoneal injection）， Fritillariae cirrhosae bulbus low-dose and high-dose groups （9.0， 18.0 mg/kg， intragastric administration）， with 10 mice in each group. Other 10 normal mice were included in normal group （0.5% carboxymethyl cellulose， intragastric administration）. They were given medicine once a day for consecutive 28 d. After medication， the number of total cells and differential cells （neutrophils， macrophages， lymphocytes and eosinophils） in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） of mice were counted. The pathological morphology of bronchial smooth muscle in mice was observed under light microscope， and the inflammatory score was scored； the activities of ERK， phosphorylated ERK （p-ERK）， p38 MAPK and phosphorylated p38 MAPK （p-p38 MAPK） were measured by ELISA. The protein expression of ERK， p-ERK， p38 MAPK and p-p38 MAPK in lung tissue were determined by Western blot assay. mRNA expression of ERK and p38 MAPK were determined by real time fluorescent quantitative PCR. RESULTS： Compared with normal group， the number of total cells and differential cells in BALF of mice， inflammation score， the activities of p-ERK and p-p38 MAPK in lung tissues were increased significantly of mice in model group （P<0.01）； the protein expression of p-ERK and p-p38 MAPK， mRNA expression of ERK and p38 MAPK were increased significantly in lung tissue of mice in model group （P<0.01）. Compared with model group， above indexes of treatment groups were all improved significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Fritillariae Cirrhosae Bulbus can improve airway inflammation in asthma model mice， the mechanisms of which may be related to inhibiting the activation of ERK/MAPK signal pathway.

KEYWORDS Fritillariae cirrhosae bulbus；Asthma；Airway inflammation；ERK/MAPK signal pathway； Mice

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種高發(fā)病率的慢性炎癥性疾病。炎癥反應(yīng)在哮喘的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，被認為是哮喘發(fā)病的可能機制之一[1-2]。如果能夠有效控制炎癥反應(yīng)，將對哮喘患者大為有利。中藥大多為天然植物，不良反應(yīng)相對較小，可作為新藥開發(fā)的很好選擇。川貝母（Fritillaria cirrhosa bulbus）是百合科植物川貝母、暗紫貝母、甘肅貝母、梭砂貝母、太白貝母或瓦布貝母的干燥鱗莖，為臨床常用中藥，其性苦、甘，微寒，有化痰止咳、清熱散結(jié)、潤肺之功效，多用于熱痰、燥痰、肺虛勞嗽、久嗽、痰少咽燥、痰中帶血等的治療[3]。臨床研究證實，溫開水調(diào)服川貝母粉可有效防治哮喘的發(fā)作[4]。本研究前期實驗也表明，川貝母對哮喘模型小鼠具有很好的保護作用[5-7]。另有研究證實，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）/絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路可介導炎癥反應(yīng)，在哮喘的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[8]。本研究旨在前期研究基礎(chǔ)上，繼續(xù)觀察川貝母對哮喘模型小鼠氣道炎癥及ERK/MAPK信號通路相關(guān)蛋白ERK、磷酸化ERK（p-ERK）、p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）的影響，探討其治療哮喘的可能作用機制。

1 材料

1.1 儀器

ABI-7300 聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）儀（美國ABI公司）；3112微量加樣器（德國Eppendorf公司）；LDZ5-2自動平衡離心機（北京京立離心機有限公司）；UW820S電子天平（日本島津公司）；402A超聲霧化器（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）；BH-2光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

川貝母（安徽億源中藥飲片科技有限公司，批號：160429），由牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)牡丹江醫(yī)學院醫(yī)藥研究中心初彥輝教授鑒定符合2015年版《中國藥典》（一部）相關(guān)要求，采用超高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法檢測西貝母堿含量為0.061%；卵蛋白（OVA）凍干粉（美國Sigma公司，批號：A5253，規(guī)格：10 mg/支）；地塞米松磷酸鈉注射液（白云山天星制藥股份有限公司，批號：160103，規(guī)格：1 mL ∶ 5 mg）； ERK、p-ERK 、p38MAP 、p-p38MAP 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（美國ADL公司，批號：A-10876-09、A-10772-09、A- 10963-09、A-20908-09）；鼠源ERK、p-ERK、p38 MAPK、p-p38 MAPK單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（美國Abbkine公司）。

1.3 動物

健康清潔級BALB/c小鼠60只，♀，6～8周齡，由哈爾濱醫(yī)科大學動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（黑）2015-001，實驗動物使用許可證號：SYXK- （黑）2015-007。動物購入后，飼養(yǎng)于恒溫（22 ℃）、相對濕度為50%的動物房中，飼養(yǎng)期間自由飲食，通風換氣為20次/h，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實驗。

2 方法

2.1 藥物制備

參照唐德才等[9]主編的《中藥學》所載，川貝母成人用劑量為3～6 g/d，根據(jù)動物體表面積等效劑量計算方法，計算小鼠給藥劑量為9.0～18.0 mg/kg。稱取川貝母粉9、18 mg，分別溶于5%羧甲基纖維素（CMC）5 mL中，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2 哮喘模型建立

取50只小鼠，于實驗第1、8天腹腔注射0.2 mg OVA+1 mg 氫氧化鋁粉末制成的混懸液0.2 mL，作為首次致敏；于實驗第15天將小鼠依次置于超聲霧化器中，用1%OVA生理鹽水噴霧激發(fā)小鼠哮喘發(fā)作，隔日1次，每次20 min，共激發(fā)10次。以小鼠出現(xiàn)口唇發(fā)紺、腹肌痙攣、呼吸加快、點頭呼吸或站立不穩(wěn)等表現(xiàn)表示激發(fā)成功。

2.3 分組與給藥

將造模成功的40只哮喘模型小鼠隨機分為模型組、陽性對照組和川貝母低、高劑量組，每組10只；另取10只正常小鼠作為正常組（以生理鹽水代替OVA進行腹腔注射及霧化吸入）。陽性對照組小鼠腹腔注射0.5 mg/kg地塞米松[10]，川貝母低、高劑量組小鼠按“2.1”項下劑量ig給藥，正常組和模型組小鼠灌胃等體積CMC溶液，各組小鼠均每天給藥1次，連續(xù)給藥28 d。

2.4 細胞計數(shù)與標本采集

給藥結(jié)束后，各組小鼠均用1%巴比妥鈉麻醉，剪掉頸部毛發(fā)后剪開皮膚，分離氣管周圍組織，氣管作一橫行切口，插入氣管插管。結(jié)扎右主支氣管，經(jīng)氣管插管以10 mL生理鹽水分3次灌洗左肺，回收的支氣管肺泡灌洗液（BALF）經(jīng)2 000 r/min（離心半徑14 cm）離心15 min，棄上清液；取沉渣用生理鹽水重懸，吸取少量細胞懸液置血細胞計數(shù)板下計數(shù)細胞總數(shù)。Diff-Quik染色液染色BALF細胞涂片后，作分類細胞（中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞）計數(shù)。切取右支氣管平滑肌，固定于10%中性福爾馬林中，用于病理組織形態(tài)學觀察。切取右肺門部位組織用于ELISA檢測、Western blot分析和實時熒光定量PCR（Real time-PCR，RT-PCR）分析。

2.5 支氣管平滑肌病理組織形態(tài)學觀察及炎癥評分

取出固定于10%中性福爾馬林中的支氣管平滑肌，常規(guī)乙醇脫水，石蠟包埋，切片（5 μm），行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察各組小鼠支氣管平滑肌病理組織形態(tài)學變化，并按照文獻[11-12]的方法進行炎癥評分。評分標準：沒有炎癥細胞，計0分；有少量炎癥細胞，計1分；炎癥細胞形成環(huán)狀，層厚1個細胞，計2分；炎癥細胞形成環(huán)狀，層厚2～4個細胞，計3分；炎癥細胞形成環(huán)狀，層厚4～5個細胞，計4分。

2.6 ELISA法檢測肺組織中ERK、p-ERK、p38 MAPK、p-p38 MAPK活性

取約1/3右肺組織，剪碎勻漿，按照相應(yīng)試劑盒說明書操作，檢測肺組織中ERK、p-ERK、p38 MAPK、p-p38 MAPK的活性，每份樣品檢測5次。

2.7 Western blot法檢測肺組織中ERK、p-ERK、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表達

取約1/3右肺組織，剪碎勻漿后，加入適量RIPA裂解液，冰上溶脹10 min，然后在4 ℃條件下15 000 r/min（離心半徑9.5 cm）離心15 min，收集上清液，二喹啉甲酸（BCA）法測定總蛋白濃度。取30 ?g蛋白上樣后行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS- PAGE）。電泳完成后，電轉(zhuǎn)至0.45 ?m的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h。分別加入相應(yīng)一抗（1 ∶ 1 000）孵育1 h。PBST洗滌后，加入辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG二抗（1 ∶ 2 000）孵育1 h。ECL化學發(fā)光試劑顯色，以β-actin為內(nèi)參，采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)對各組條帶灰度值進行分析，以目標蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目標蛋白的相對表達水平。每份樣品設(shè)5個平行孔。

2.8 RT-PCR法檢測肺組織中ERK、p38 MAPK mRNA表達

Trizol試劑提取剩余右肺組織總RNA，檢測RNA純度，反轉(zhuǎn)錄合成單鏈的cDNA，將cDNA產(chǎn)物保存在-20 ℃冰箱中。利用PubMed查找相關(guān)基因序列，并利用引物合成軟件Primer Premier 5.0設(shè)計引物。反應(yīng)體系總體積為25 ?L。反應(yīng)程序：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min結(jié)束反應(yīng)。每個樣本均以內(nèi)參基因β-actin調(diào)整，采用2-ΔΔct法定量分析ERK、p38 MAPK mRNA表達（ct值表示目標基因達到設(shè)定閾值所需的循環(huán)次數(shù)），每份樣品檢測5次。引物序列及擴增長度見表1。

2.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，采用單因素方差分析進行組間比較，方差齊時組間兩兩比較采用LDS檢驗，方差不齊時采用Games-Howell檢驗；等級資料采用秩和檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠BALF總細胞和分類細胞計數(shù)結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠BALF總細胞和分類細胞計數(shù)均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，陽性對照組和川貝母低、高劑量組小鼠BALF總細胞和分類細胞計數(shù)均顯著降低（P<0.05或P<0.01），結(jié)果見表2。

3.2 各組小鼠支氣管平滑肌病理組織形態(tài)學觀察結(jié)果

正常組小鼠支氣管管腔內(nèi)無上皮細胞脫落，管壁完整，無明顯炎癥細胞浸潤，支氣管黏膜平整，平滑肌呈正常厚度；模型組小鼠支氣管壁中有大量炎細胞浸潤，主要是嗜酸性粒細胞和淋巴細胞，支氣管黏膜上皮脫落，水腫，管腔內(nèi)有明顯分泌物，平滑肌增厚，提示哮喘模型復制成功；陽性對照組及川貝母低、高劑量組小鼠支氣管管腔內(nèi)少量黏液和脫落細胞，支氣管噬酸性粒細胞和其他炎性細胞浸潤有所減少，幾近消失，黏膜平整規(guī)則，平滑肌厚度幾乎接近正常組，病理切片圖見圖1。

半定量分析結(jié)果表明，與正常組比較，模型組小鼠炎癥評分顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，陽性對照組及川貝母低、高劑量組小鼠炎癥評分均顯著降低（P<0.01），結(jié)果見表3。

3.3 各組小鼠肺組織中ERK、p-ERK、p38 MAPK、p-p38 MAPK活性測定結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠肺組織中p-ERK、 p-p38 MAPK活性均顯著升高（P<0.01），ERK、 p38 MAPK活性差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠肺組織中p-ERK、p-p38 MAPK活性均顯著降低（P<0.05或P<0.01），ERK、p38 MAPK活性差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），結(jié)果見表4。

3.4 各組小鼠肺組織ERK、p38 MAPK、p-ERK和p-p38 MAPK蛋白表達測定結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠肺組織中p-ERK、 p-p38 MAPK蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01），ERK、p38 MAPK蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠肺組織中p-ERK、p-p38 MAPK蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），ERK、p38 MAPK蛋白水平表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。電泳圖見圖2，測定結(jié)果見表5。

3.5 各組小鼠肺組織ERK、p38 MAPK mRNA表達測定結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠肺組織中ERK、 p38 MAPK mRNA表達水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠肺組織中ERK、p38 MAPK mRNA表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），結(jié)果見表6。

4 討論

哮喘是由多種炎癥細胞、細胞因子和炎癥介質(zhì)共同參與的氣道慢性炎癥性疾病[13]。氣道炎癥在哮喘的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而目前國內(nèi)外通用的哮喘診治方案均強調(diào)對氣道炎癥的控制[14]。氣道炎癥包括多種炎性細胞參與，如中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞等[15]。動物實驗研究表明，BALF中存在大量的中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒，上述細胞活化是哮喘的典型特征[16-17]。哮喘誘發(fā)了機體的免疫反應(yīng)，引起中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞活化，并向炎癥部位趨化、聚集，從而釋放炎性介質(zhì)（如內(nèi)皮素、血小板活化因子、白三烯、組胺等），直接或間接損傷了氣道上皮細胞，引發(fā)氣道炎癥[18]。因此，中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞也稱為哮喘的主要炎癥效應(yīng)細胞，與哮喘的嚴重程度呈正相關(guān)，是哮喘臨床診斷最為重要的指標。本研究顯示，正常組小鼠BALF中總細胞計數(shù)和分類細胞計數(shù)較少，而模型組小鼠BALF中存在大量的中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞，該結(jié)果與以往研究相一致[19-20]。給予川貝母干預以后，川貝母低、高劑量組小鼠BALF中總細胞計數(shù)和分類細胞計數(shù)均較模型組降低。以上結(jié)果提示，川貝母可有效抑地制哮喘模型小鼠氣道炎癥反應(yīng)，改善哮喘癥狀。同時，本研究支氣管平滑肌病理組織形態(tài)學觀察顯示，正常組小鼠炎癥評分較低，而模型組炎癥評分較高，給予川貝母干預以后，川貝母低、高劑量組小鼠炎癥評分均較模型組降低，這進一步提示川貝母可有效抑制哮喘模型小鼠氣道炎癥反應(yīng)，改善哮喘癥狀。

為了進一步闡明川貝母抑制哮喘模型小鼠氣道炎癥反應(yīng)的可能機制，本研究從ERK/MAPK信號通路角度進行了分析。MAPK是連接細胞膜表面受體與決定基因表達之間的重要信號調(diào)節(jié)酶，因此MAPK信號轉(zhuǎn)導通路是將細胞外信號傳導入胞內(nèi)的重要信號轉(zhuǎn)導途徑[20]。MAPK信號通路在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，主要包括分別由ERK、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、p38 MAPK介導的三條級聯(lián)反應(yīng)，該通路的激活可促進炎癥細胞因子的生成而加劇炎癥反應(yīng)[21-22]。研究表明，ERK受上游特異性刺激分子雙磷酸化激活，活化的p-ERK形成二聚體，從細胞質(zhì)移位到細胞核，通過調(diào)控一系列轉(zhuǎn)錄因子，而引起炎癥反應(yīng)；p38 MAPK是信號從細胞表面?zhèn)鲗е良毎藘?nèi)部的重要傳遞者，通過對轉(zhuǎn)錄因子磷酸化來調(diào)節(jié)參與細胞反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄表達。p38 MAPK介導基因表達和炎癥因子產(chǎn)生，調(diào)控炎性細胞的增殖、分化和凋亡等，參與慢性氣道疾病的氣道炎癥機制[23]。因此，可以認為ERK和p38 MAPK發(fā)生磷酸化后可激活ERK/MAPK信號轉(zhuǎn)導通路。另有研究表明，在哮喘模型中，ERK/MAPK信號通路相關(guān)蛋白的活性增強[7]。本研究顯示，正常組小鼠肺組織中p-ERK，p-p38 MAPK活性和表達及ERK 、p38 MAPK mRNA表達均較低，而模型組小鼠肺組織中p-ERK、p-p38 MAPK活性和表達及ERK 、p38 MAPK mRNA表達均較正常組明顯增加，表明ERK/MAPK信號通路被激活；給予川貝母干預以后，川貝母低、高劑量組小鼠肺組織中p-ERK、p-p38 MAPK活性和表達及ERK、p38 MAPK mRNA表達均較模型組降低。

綜上所述，中藥川貝母可有效抑制哮喘模型小鼠的炎癥反應(yīng)，其機制可能與抑制ERK/MAPK信號通路激活有關(guān)。至于是否存在其他機制，如是否還與JNK信號通路有關(guān)，本課題組將繼續(xù)探討。

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（收稿日期：2017-06-20 修回日期：2017-10-09）

（編輯：林 靜）