金釵石斛葉中總黃酮的提取分離及體外抗阿爾茨海默病活性研究

李艷萍　李海燕　紀(jì)曉婉　岑志芳　顏金武　吳劍峰

中圖分類(lèi)號(hào) R961 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）03-0330-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.03.10

摘 要 目的：對(duì)金釵石斛葉中總黃酮進(jìn)行提取分離，并考察其體外抗阿爾茨海默病（AD）活性。方法：采用超聲提取法提取金釵石斛葉中總黃酮，將所得浸膏用水分散后分別用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取，采用顯色反應(yīng)和薄層色譜法對(duì)各極性提取物進(jìn)行定性分析，硝酸鋁-亞硝酸鈉法定量分析各提取物中總黃酮含量。采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除試驗(yàn)考察各提取物的體外抗氧化活性，硫黃素T法考察各提取物對(duì)Aβ42蛋白聚集的抑制作用，紫外-可見(jiàn)光譜掃描法測(cè)定各提取物對(duì)金屬離子（Cu2+，F(xiàn)e3+和Zn2+）的螯合能力，以考察其體外抗AD活性。結(jié)果：乙酸乙酯、正丁醇、水提取物中均含有黃酮成分，含量分別為0.03、0.12、0.05 mg/mL。3種提取液對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除濃度（IC50）分別為0.021、0.011、0.013 mg/mL，對(duì)Aβ42蛋白聚集的抑制率分別為43.77%、52.28%、38.42%，對(duì)金屬離子具有一定的螯合能力，其中尤以對(duì)Cu2+的螯合作用最為明顯。結(jié)論：金釵石斛葉中總黃酮具有較好的抗氧化、抑制Aβ42蛋白聚集及螯合金屬離子的能力，具有一定的體外抗AD活性，且以正丁醇提取物效果最明顯。

關(guān)鍵詞 金釵石斛葉；黃酮成分；阿爾茨海默??；抗氧化；Aβ42蛋白

ABSTRACT OBJECTIVE： To separate and isolate total flavonoids from Dendrobium nobile leaves， and to investigate its anti-Alzheimers disease （AD） activity in vitro. METHODS： Total flavonoids were obtained by ultrasonic extraction method and extracted by chloroform， ethyl acetate and butyl alcohol after the obtained extract was dispersed with water. Qualitative analysis was carried out with color reaction and TLC. The content of total flavonoids in extracts was analyzed quantitatively by Aluminum nitrate-sodium nitrite method. Antioxidant activity of extract was investigated by DPPH radical scavenging assay； the inhibitory effect of each extract on Aβ42 protein aggregation was investigated by Thioflavin T assay. Metals （Cu2+， Fe3+， Zn2+） chelating property was studied by UV-vis spectrum scanning to investigate the anti-AD activity in vitro. RESULTS： The flavonoids were found in ethyl acetate， butyl alcohol and aqueous extracts， and their flavonoids contents were 0.03， 0.12， 0.05 mg/mL， respectively. IC50 of three extracts to DPPH free radicals were 0.021， 0.011， 0.013 mg/mL. Inhibitory rates of them to Aβ42 protein aggregation were 43.77%， 52.28%， 38.42%， respectively. Three extracts exerted metal chelating ability which was best in Cu2+. CONCLUSIONS： The total flavonoids from D. nobile leaves have good antioxidant activities， Aβ42 aggregation inhibitory activities and metal chelating activity， show certain anti-AD activity in vitro especially in butyl alcohol extract.

KEYWORDS Dendrobium nobile leaves； Flavonoids； Alzheimers disease； Antioxidant； Aβ42 protein

金釵石斛（Dendrobium nobile）作為我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，為蘭科石斛屬植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，主要以新鮮或干燥莖入藥[1]，是2015年版《中國(guó)藥典》（一部）中藥用石斛的首要來(lái)源。一直以來(lái)，人們主要對(duì)其莖部開(kāi)展相關(guān)化學(xué)成分和藥理作用研究，發(fā)現(xiàn)有效成分主要是石斛堿和多糖類(lèi)物質(zhì)，藥理活性主要有增強(qiáng)免疫力和抗腫瘤等。至今，對(duì)金釵石斛葉和花部位的研究很少。

阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease，AD）是一種神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病率占老年性癡呆的60%～80%，目前AD尚無(wú)有效的治療藥物[2]。由于AD的病理特征復(fù)雜，多靶點(diǎn)抗AD研究已成為抗AD藥物研發(fā)的熱門(mén)方向，其主要靶點(diǎn)包括膽堿酯酶、Aβ蛋白、自由基以及金屬離子等[3]。黃酮是一類(lèi)天然抗氧化劑，具有抗氧化、降血糖和保護(hù)心血管等作用。近年來(lái)，多種黃酮類(lèi)物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)具有良好的抗AD活性。有研究指出，日常飲食中攝入一定量的黃酮成分有助于AD的治療[4]。相比莖部來(lái)說(shuō)，金釵石斛葉中黃酮類(lèi)成分含量更高[5]。本研究擬通過(guò)提取分離手段獲得金釵石斛葉中總黃酮，并對(duì)其進(jìn)行初步的體外抗AD活性評(píng)價(jià)，為金釵石斛葉這一資源的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BS-110S電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；硅膠G板（德國(guó)Merck公司）；TLC Visualizer薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（瑞士CAMAG公司）；UV-1600 PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；WFY-28熒光分光光度計(jì)（天津市拓普儀器有限公司）；RT-6100酶標(biāo)分析儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）。

1.2 藥材與試劑

金釵石斛葉（廣東國(guó)方醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：2016-05-28，經(jīng)佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院李海燕副教授鑒定為真品）；蘆丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100080-200707，純度：99.0%）；Aβ42蛋白（上海強(qiáng)耀生物有限公司，批號(hào)：2016-01-20，純度：>95%）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、姜黃素、硫磺素T（美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：101585784、1002008101、1002- 142019，純度：>97%、>98%、60%～75%）；水溶性維生素E（Trolox，上海阿拉丁生物科技有限公司）；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 金釵石斛葉中總黃酮的提取

將新鮮金釵石斛葉清洗、烘干至恒質(zhì)量，研碎成粉末。精確稱(chēng)取粉末4 g，用濾紙包好放入索氏提取器中，加入140 mL石油醚回流脫脂[6]，虹吸至提取液接近無(wú)色。取出濾渣，置于錐形瓶中，加80%乙醇室溫下超聲提取，每次35 min，直至提取液顏色接近無(wú)色。合并提取液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干溶液，得浸膏。將浸膏懸浮于水，分別用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，每種溶劑連續(xù)萃取至無(wú)色，合并相同溶劑的萃取液，分別減壓濃縮后得到4種提取物。然后將4種提取物分別用80%乙醇溶解并定容至25 mL量瓶中，得到氯仿提取物溶液（A溶液）、乙酸乙酯提取物溶液（B溶液）、正丁醇提取物溶液（C溶液）和水提取物溶液（D溶液）。

2.2 黃酮成分的定性分析

2.2.1 顯色反應(yīng)法 分別采用鹽酸-鎂粉反應(yīng)法、堿性試劑顯色反應(yīng)法、鋁鹽反應(yīng)法、醛糖形成反應(yīng)（Molish反應(yīng)）和三氯化鐵反應(yīng)法[7]定性分析4種提取物溶液中含黃酮成分情況。結(jié)果，A溶液在鹽酸-鎂粉反應(yīng)和三氯化鐵反應(yīng)中顯色不明顯，在堿性試劑顯色反應(yīng)和鋁鹽反應(yīng)中呈陰性，僅在Molish反應(yīng)中呈陽(yáng)性；而B(niǎo)、C、D溶液在5種顯色反應(yīng)中均呈陽(yáng)性。結(jié)果提示，B、C、D溶液中含有黃酮成分。

2.2.2 薄層色譜法 取A、B、C、D溶液點(diǎn)樣在硅膠G薄層板上，以正丁醇-醋酸-水（4 ∶ 1 ∶ 5，V/V/V，下同）為展開(kāi)劑展開(kāi)后，取出，自然晾干，噴1% AlCl3溶液[8]，揮干后在薄層色譜數(shù)碼成像中觀察斑點(diǎn)情況。結(jié)果，B、C、D溶液中均有出現(xiàn)條帶，而A溶液中沒(méi)有。結(jié)合顯色反應(yīng)與薄層色譜結(jié)果，表明除了A溶液，其余3種提取液中均存在黃酮類(lèi)成分。薄層色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3 總黃酮含量測(cè)定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品0.010 1 g，用80%乙醇定容至50 mL量瓶中，搖勻，得對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照品溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，分別置于10 mL量瓶中，不足5 mL的加80%乙醇補(bǔ)足5 mL；精密加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；然后加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；再加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL，最后用80%乙醇定容，搖勻，放置15 min[9-10]。在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)（y）、蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=13.526x-0.013 95（R2=0.998 8）。結(jié)果表明，蘆丁檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.02～0.10 mg/mL。

2.3.2 含量測(cè)定 精密量取B、C、D溶液各2 mL于10 mL量瓶中，按“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，并由回歸方程計(jì)算各樣品中總黃酮含量。結(jié)果，B、C、D溶液中總黃酮含量分別為0.03、0.12、0.05 mg/mL，折算成每克葉中的含量分別為0.38、1.57、0.63 mg/g。從結(jié)果可知，各提取物中總黃酮含量大小順序?yàn)镃溶液>D溶液>B溶液。

2.4 DPPH自由基清除能力

2.4.1 溶液的制備 （1）DPPH溶液：稱(chēng)取0.001 1 g的DPPH，用80%乙醇溶解并定容于25 mL量瓶中，搖勻，得濃度為100 μmol/L的溶液，保存于冰箱中，備用[11-12]。（2）Trolox溶液：稱(chēng)取0.009 7 g 的Trolox，用無(wú)水乙醇溶解并定容于5 mL 量瓶中，搖勻。然后稀釋至80、60、40、20 μmol/L，備用。（3）樣品溶液：精密量取B溶液250、200、150、100、50、20 μL，C溶液150、125、100、75、50、25 μL，D溶液225、200、175、150、125、100 μL，分別置于離心管中，再分別加入80%乙醇補(bǔ)足體積至500 μL。

2.4.2 DPPH自由基清除試驗(yàn) 量取以上稀釋好的Trolox溶液和B、C、D樣品液各100 μL，再加入100 μL的DPPH溶液?？瞻兹芤簽?0%乙醇，陰性對(duì)照為100 μL的80%乙醇與100 μL的DPPH溶液的混合液。充分混合后，室溫避光放置50 min，然后用酶標(biāo)分析儀于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度（A），所有樣品均重復(fù)3次。計(jì)算DPPH自由基清除率。清除率（%）=[（A對(duì)-A空）- （A樣-A空）]/（A對(duì)-A空），式中，A對(duì)為陰性對(duì)照的A，A樣為樣品溶液與DPPH反應(yīng)后的A，A空為空白溶液的A。根據(jù)清除率與各樣品濃度的擬合曲線計(jì)算其半數(shù)清除濃度（IC50）。結(jié)果表明，對(duì)照品Trolox對(duì) DPPH自由基的IC50為28.85 μmol/L（0.007 mg/mL），B、C、D溶液對(duì)DPPH自由基的IC50分別為0.021、0.011、0.013 mg/mL。

2.5 Aβ42蛋白聚集抑制活性

精密稱(chēng)取Aβ42蛋白0.2 mg，用1%NH3·H2O溶液100 μL溶解，然后用20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋至20 μmol/L。取B、C、D溶液各150 μL，分別加入150 μL的Aβ42蛋白溶液作為樣品溶液，陰性對(duì)照為150 μL的 Aβ42蛋白溶液與150 μL磷酸鹽緩沖液，陽(yáng)性對(duì)照為20 μmol/L的姜黃素溶液。樣品空白分別為B、C、D溶液以及姜黃素溶液各150 μL與150 μL緩沖溶液的混合液，背景空白為300 μL的緩沖溶液與2 700 μL的硫磺素T溶液的混合液。將上述溶液混勻后，在37 ℃條件下反應(yīng)72 h，然后分別加入2 700 μL的硫磺素T溶液（5 μmol/L，用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液配制），混勻，反應(yīng)2 min。最后測(cè)試熒光吸收值，其中激發(fā)波長(zhǎng)為450 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為482 nm[13]。每個(gè)樣品均重復(fù)3次，計(jì)算Aβ42蛋白聚集抑制率[Aβ42蛋白聚集抑制率（%）=（1-IFi/IFc）×100%。式中，IFi指樣品扣除樣品空白后的熒光吸收值，IFc指陰性對(duì)照扣除背景空白后的熒光吸收值]。結(jié)果顯示，對(duì)照品姜黃素的Aβ42蛋白聚集抑制率為50.35%，B、C、D溶液的Aβ42蛋白聚集抑制率分別為43.77%、52.28%、38.42%。結(jié)果提示，B、C、D溶液對(duì)Aβ42蛋白聚集均有較好的抑制活性，其中活性大小順序?yàn)镃溶液>B溶液>D溶液。

2.6 金屬離子螯合能力

稱(chēng)取0.002 5 g的CuSO4·5H2O、0.002 7 g的FeCl3·6H2O和0.002 9 g的ZnSO4·7H2O，分別用80%乙醇溶解并定容至10 mL量瓶中，制備濃度均為1 mmol/L的Cu2+、Fe3+和Zn2+溶液。精密量取B、C、D溶液各1 mL，置于不同EP管中，加入80%乙醇溶液4 mL進(jìn)行稀釋?zhuān)瑩u勻。各取3份上述稀釋液1 mL置于試管中，分別加入Cu2+溶液200 μL、Fe3+溶液200 μL和Zn2+溶液400 μL，然后用80%乙醇溶液稀釋至4 mL。參比溶液為以80%乙醇為溶劑的等濃度同種離子溶液[13]。混勻后室溫放置30 min[14]。常溫下用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，波長(zhǎng)范圍為200～500 nm，波長(zhǎng)間隔為1 nm，掃描速率為200 nm/min。各溶液對(duì)金屬離子螯合能力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，B、C、D溶液與Cu2+、Fe3+和Zn2+作用后吸收光譜均出現(xiàn)一定的變化，其中與Cu2+作用后吸光譜改變最為明顯?？芍?，這3種溶液對(duì)Cu2+、Fe3+、Zn2+等金屬離子均表現(xiàn)出一定的螯合能力，且以對(duì)Cu2+螯合能力最強(qiáng)。

3 討論

3.1 總黃酮的提取與分離方法

本文在提取總黃酮前，先用石油醚進(jìn)行脫脂，以便除去葉綠素等脂溶性色素，減少對(duì)顯色反應(yīng)和其他試驗(yàn)結(jié)果的影響。另外，本文曾對(duì)比回流法與超聲法的提取效率[15]，發(fā)現(xiàn)后者提取效率是前者的3倍多，因此采用后者作為總黃酮的提取方法。本研究的萃取試劑選用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇這3種不同極性的溶劑，目的是分離不同極性的黃酮類(lèi)成分，獲得黃酮苷與苷元。在萃取過(guò)程中，正丁醇與水層之間容易出現(xiàn)乳化，加大正丁醇和水層之間的比例或者靜置過(guò)夜可有效減少乳化現(xiàn)象。

3.2 金釵石斛葉中黃酮成分的性質(zhì)

在薄層色譜試驗(yàn)中，筆者曾嘗試以正丁醇-醋酸-水（4 ∶ 1 ∶ 5）、正丁醇-醋酸-水（6 ∶ 1 ∶ 5）、甲醇-水（1 ∶ 1）、氯仿-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（50 ∶ 5 ∶ 10 ∶ 1）、氯仿-甲醇-水（4 ∶ 1 ∶ 0.1）、氯仿-甲醇-甲酸（15 ∶ 5 ∶ 1）等為展開(kāi)劑，發(fā)現(xiàn)以正丁醇- 醋酸-水（4 ∶ 1 ∶ 5）分離效果最好，斑點(diǎn)清晰，故最終采用此條件。定性試驗(yàn)結(jié)果表明，乙酸乙酯、正丁醇和水提取物中均存在黃酮類(lèi)成分，而氯仿提取物中則沒(méi)有，并且黃酮含量大小順序?yàn)檎〈继崛∥?水提取物>乙酸乙酯提取物。這表明金釵石斛葉中黃酮類(lèi)物質(zhì)的極性較大，并且極性大的成分含量比較高，可能主要以黃酮苷的形式存在。目前鮮有金釵石斛葉中黃酮化學(xué)成分的報(bào)道，這一研究結(jié)果對(duì)于筆者后續(xù)進(jìn)行黃酮單體成分的分離具有重要的指導(dǎo)意義。

3.3 金釵石斛葉中黃酮成分的體外抗AD活性

本研究初步考察了金釵石斛葉中黃酮成分對(duì)AD的靶點(diǎn)——Aβ42蛋白、自由基以及金屬離子的影響。其中，Aβ42蛋白是AD患者腦部淀粉樣斑塊的主要成分，是一個(gè)大約4.2 kDa的短肽，Aβ42蛋白的聚集是其產(chǎn)生神經(jīng)毒性的前提。自由基的產(chǎn)生和清除失衡會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中DNA、脂質(zhì)、多糖和蛋白質(zhì)過(guò)度損傷，是引發(fā)AD患者神經(jīng)元功能障礙的重要原因[16]。在AD患者腦部，金屬離子Cu2+、Fe3+、Zn2+的濃度異常升高，這些金屬離子可以與Aβ42蛋白結(jié)合而促進(jìn)其聚集，并且能夠催化活性氧的產(chǎn)生，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)[17]。因此，抑制Aβ42蛋白的聚集、清除自由基以及金屬離子將有利于AD的治療。結(jié)合含量測(cè)定和活性研究結(jié)果可以看出，含有黃酮成分的乙酸乙酯、正丁醇和水提取物在抗氧化、抑制Aβ42蛋白聚集和螯合金屬離子方面均表現(xiàn)出良好的活性，并且活性大小順序基本與黃酮含量大小順序一致。其中正丁醇提取物中黃酮成分的含量最高，活性也最好，值得進(jìn)行下一步的單體成分的分離研究。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)金釵石斛葉中黃酮類(lèi)化合物研究較少，本研究分離獲得了金釵石斛葉中的黃酮成分，并發(fā)現(xiàn)其在抗AD方面具有良好的活性，值得進(jìn)行深入研究，而本研究結(jié)果可以為更好地開(kāi)發(fā)利用金釵石斛葉這一資源提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

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（收稿日期：2017-08-14 修回日期：2017-11-13）

（編輯：林 靜）