救必應(yīng)酸的單體制備及RP—HPLC法測定救必應(yīng)藥材及精制品中3種活性成分的含量

王圓　高兵　陳華　張雷

中圖分類號 R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）03-0326-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.03.09

摘 要 目的：制備高純度的救必應(yīng)酸并測定救必應(yīng)藥材及精制品中3種活性成分紫丁香苷、長梗冬青苷、救必應(yīng)酸的含量。方法：采用醇提法制備救必應(yīng)皂苷，以甲醇和氫氧化鈉進(jìn)一步水解，并經(jīng)重結(jié)晶后得到救必應(yīng)酸單體。采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測定救必應(yīng)藥材及精制品1和精制品2中紫丁香苷、長梗冬青苷、救必應(yīng)酸的含量。色譜柱為Agilent XDB C18，流動相為水-乙腈（梯度洗脫），柱溫為30 ℃，流速為1.2 mL/min，檢測波長為210 nm，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：所制救必應(yīng)酸純度達(dá)99%以上。紫丁香苷、長梗冬青苷、救必應(yīng)酸進(jìn)樣量分別在0.18～3.22、0.59～10.36、0.20～3.53 μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系（r均為0.999 9），精密度、穩(wěn)定性（24 h）、重復(fù)性試驗的RSD均小于2.0%（n=6～7），平均加樣回收率為96.08%～100.81%（RSD≤1.98%，n=6）。紫丁香苷、長梗冬青苷、救必應(yīng)酸的含量在救必應(yīng)藥材中分別為1.61%、7.26%、1.29%（RSD≤1.08%，n=3），在精制品1中分別為0、82.59%、4.18%（RSD≤1.67%，n=3）；在精制品2中分別為0、73.29%、7.41%（RSD≤1.15%，n=3）。結(jié)論：所制救必應(yīng)酸純度高、制備方法簡單且安全環(huán)保。建立的RP-HPLC法簡單、可靠，可滿足快速測定救必應(yīng)藥材及其精制品含量的要求。

關(guān)鍵詞 救必應(yīng)；紫丁香苷；長梗冬青苷；救必應(yīng)酸；制備；反相高效液相色譜法

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare high-purity rotundic acid， and to determine the contents of syringoside， peduncloside and rotundic acid in Ilicis rotundae and its refined products. METHODS： I. rotundae saponins was prepared by ethanol extraction method and hydrolyzed with methanol and sodium hydroxide； rotundic acid monomer was obtained after recrystallization. The contents of syringoside， peduncloside and rotundic acid in I. rotundae， its refined product 1 and its refined product 2 were determined by RP-HPLC. The determination was performed on an Agilent XDB C18 column with mobile phase consisted of water-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 1.2 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and the detection wavelength was set at 210 nm. The sample size was 10 μL. RESULTS： The purity of rotundic acid exceeded 99%. The linear ranges of syringing， peduncloside and rotundic acid were 0.18-3.22， 0.59-10.36 and 0.20-3.53 μg， respectively （r=0.999 9）. RSDs of precision， stability （24 h） and reproducibility tests were all lower than 2.0% （n=6-7）. The average recoveries were 96.08%-100.81%（RSD≤1.98%，n=6）. The contents of syringoside， peduncloside and rotundic acid in I. rotundae were 1.61%， 7.26%， 1.29% （RSD≤1.08%， n=3）； those of refined product 1 were 0， 82.59%， 4.18% （RSD≤1.67%， n=3）； those of refined product 2 were 0， 73.29%， 7.41% （RSD≤1.15%，n=3）， respectively. CONCLUSIONS： Prepared rotundic acid has high purity and is simple in preparation， safe and environmentally-friendly. RP-HPLC method that established is simple and reliable， and can meet the requirements for rapid analysis of I. rotundae and its refined products.

KEYWORDS Ilicis rotundae； Syringoside； Peduncloside； Rotundic acid； Preparation； RP-HPLC

救必應(yīng)（Ilicis rotundae Cortex）為冬青科植物鐵冬青（Ilex rotunda Thunb）的干燥樹皮，收載于2015年版《中國藥典》（一部）[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，救必應(yīng)藥材中的活性成分分別為紫丁香苷、長梗冬青苷、救必應(yīng)酸，在治療心血管疾病[2-4]、抗腫瘤[5-7]、消腫止痛[8-10]等方面具有明顯作用。在已報道的文獻(xiàn)中，從救必應(yīng)藥材中采用水解和柱層析法精制得到救必應(yīng)酸，總收率約為5%[6]。另在分析研究中，已報道的采用高效液相色譜（HPLC）法測定救必應(yīng)藥材中紫丁香苷、長梗冬青苷、救必應(yīng)酸、丁香脂素4′ -O-β-D-吡喃葡萄糖苷4種成分的含量的方法分析時間較長，救必應(yīng)酸的出峰時間在40 min后，且流動相中的無機(jī)酸可能造成救必應(yīng)苷的水解而影響含量測定準(zhǔn)確性[11-12]。文獻(xiàn)中純化救必應(yīng)酸過程采用硅膠分離方法，操作較為煩瑣，展開劑使用量大[6]。本研究改善制備工藝以制備救必應(yīng)酸單體，并進(jìn)一步優(yōu)化含量測定的HPLC條件，為藥材及精制品中紫丁香苷、長梗冬青苷、救必應(yīng)酸含量測定提供更準(zhǔn)確、快速的評價方法。

1 材料

1.1 儀器

1200型HPLC儀（美國Agilent公司）；SB-3200DT型超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；TP-114型電子天平[丹佛儀器（北京）有限公司]；Quattro Micro API型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；600 MHz Advance型核磁共振（NMR）波譜儀（德國Bruker公司）。

1.2 藥材與試劑

救必應(yīng)藥材（廣州清平藥材市場，經(jīng)中山大學(xué)藥學(xué)院蘇薇薇教授鑒定為冬青科植物鐵冬青Ilex rotunda Thunb.的干燥樹皮，密封干燥常溫保存）；紫丁香苷對照品（批號：111574-201504，純度：94.9%）、長梗冬青苷對照品（批號：11868-201001，純度：89.3%）均購自中國食品藥品檢定研究院；救必應(yīng)酸為華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院醫(yī)藥生物學(xué)實驗室自制（面積歸一化法檢測質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于99%）；采用甲醇溶劑降溫重結(jié)晶方法代替文獻(xiàn)[6]中的硅膠柱層析方法得到救必應(yīng)精制品1；采用甲醇飽和溶液加水析晶方法代替文獻(xiàn)[6]中的硅膠柱層析方法得到救必應(yīng)精制品2（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院醫(yī)藥生物學(xué)實驗室自制）；乙腈為色譜純（德國Merck公司）；水為超純水；其余試劑均為化學(xué)純。

2 方法與結(jié)果

2.1 救必應(yīng)酸的制備及結(jié)構(gòu)確證

按文獻(xiàn)[6]的提取工藝得到救必應(yīng)皂苷。將10.0 g救必應(yīng)皂苷先后溶解于20 mL 甲醇和100 mL的2 mol/L 的氫氧化鈉溶液中，回流反應(yīng)2 h。然后用鹽酸酸化反應(yīng)液，靜置過濾。向濾渣中加入30 mL水和10 mL乙醇，在50 ℃下重結(jié)晶2次，干燥得救必應(yīng)酸。采用Quattro Micro API型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀和600 MHz Advance型 NMR波譜儀確證救必應(yīng)酸的結(jié)構(gòu)，并測定其純度。救必應(yīng)酸的高分辨質(zhì)譜圖見圖1。

電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）顯示準(zhǔn)分子離子峰，其質(zhì)荷比m/z為511.340 5（[M+Na]+，理論值為511.341 2），純化產(chǎn)物核磁共振氫譜（1H-NMR）和核磁共振碳譜（13C-NMR）核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中數(shù)據(jù)對照一致[13]。經(jīng)面積歸一化法得出自制救必應(yīng)酸純度達(dá)99.0%。本研究采用重結(jié)晶方法代替文獻(xiàn)[6]中硅膠分離法，操作更簡單，同時還能減少展開劑使用。同時救必應(yīng)酸單體在甲醇中溶解度大，向甲醇溶液中加水后會析出救必應(yīng)酸，方便純化。另外，采用17%甲醇回流，相比較文獻(xiàn)30%乙醇，有機(jī)溶劑使用量減少，符合環(huán)保的要求。

2.2 反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測定紫丁香苷、長梗冬青苷、救必應(yīng)酸含量

2.2.1 混合對照品溶液制備 取紫丁香苷對照品、長梗冬青苷對照品、救必應(yīng)酸對照品適量，精密稱定，加甲醇配制成含紫丁香苷0.09 mg/mL、長梗冬青苷0.30 mg/mL、救必應(yīng)酸0.10 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備[1] 取適量干燥的救必應(yīng)藥材粉碎，過3號篩。精密稱定0.1 g粉末，加入甲醇25 mL，超聲（功率：180 W，頻率：40 kHz）提取 30 min，待冷卻后用甲醇補(bǔ)充超聲前后的差量，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性考察 色譜柱：Agilent XDB C18（250 mm×4. 6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min，10%～12%B；5～20 min，12%～50%B；20～30 min，50%B）；流速：1.2 mL/min；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：10 μL。取“2.2.1” “2.2.2”項下溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示，其他成分對紫丁香苷、長梗冬青苷、救必應(yīng)酸的測定無干擾。理論板數(shù)以3種待測成分計均大于3 000，且紫丁香苷、長梗冬青苷、救必應(yīng)酸與相鄰峰分離度均大于1.5。對照品和供試品的色譜圖見圖2。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別吸取2、5、10、15、20、25、30、35 μL混合對照品溶液進(jìn)樣測定。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得紫丁香苷、長梗冬青苷、救必應(yīng)酸的回歸方程分別為y=1 606.92x+53.85、y=172.44x+0.52、y=248.21 x-1.97（r均為 0.999 9）。結(jié)果表明，紫丁香苷、長梗冬青苷、救必應(yīng)酸檢測進(jìn)樣量線性范圍為0.18～3.22、0.59～10.36、0.20～3.53 μg。

2.2.5 定量限與檢測限考察 將對照品溶液逐步稀釋，進(jìn)樣。在信噪比為10時測定紫丁香苷、長梗冬青苷、救必應(yīng)酸的定量限分別為14.2、95.0、176.9 ng，在信噪比為3時測得3種物質(zhì)的檢測限分別為4.1、49.4、67.3 ng。

2.2.6 精密度試驗 重復(fù)進(jìn)樣混合對照品溶液6次，記錄3種成分的峰面積，并計算RSD。結(jié)果，紫丁香苷、長梗冬青苷、救必應(yīng)酸峰面積RSD分別為1.22%、0.63%、0.94%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 精密稱量6份藥材粉末，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定3種成分的量。結(jié)果，紫丁香苷、長梗冬青苷、救必應(yīng)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值分別為1.61%、7.24%、1.30%（n=6），對應(yīng)RSD分別為0.83%、1.54%、1.97%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液室溫放置。分別于0、2、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣測定。結(jié)果，紫丁香苷、長梗冬青苷、救必應(yīng)酸含量的RSD分別為0.47%、0.96%、0.41%（n=7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收率試驗 平行稱量6份已知含量的救必應(yīng)藥材0.1 g，根據(jù)救必應(yīng)藥材中3種成分的含量分別加入一定量的單個對照品溶液，按“2.2.2”項下制備供試品溶液。進(jìn)樣測定3種成分的含量，計算加樣回收率。結(jié)果，紫丁香苷、長梗冬青苷、救必應(yīng)酸的平均加樣回收率分別為98.90%、100.81%、96.08%（n=6），RSD分別為1.72%、1.55%、1.98%（n=6），表明本法測定準(zhǔn)確度良好，符合含量測定要求。

2.2.10 樣品測定 取救必應(yīng)藥材、精制品1和精制品2制備的供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進(jìn)行測定，以外標(biāo)法計算各樣品中紫丁香苷、長梗冬青苷、救必應(yīng)酸的量，結(jié)果見表1。

由表1可見，救必應(yīng)藥材中紫丁香苷、長梗冬青苷、救必應(yīng)酸含量分別為1.61%、7.26%、1.29%。與救必應(yīng)藥材比較，精制品1和精制品2中均未檢測到紫丁香苷成分，長梗冬青苷、救必應(yīng)酸因精制工藝不同而含量不同。

3 討論

本研究優(yōu)化了救必應(yīng)酸提取純化方法和3種成分含量測定的RP-HPLC方法，采用重結(jié)晶方法代替普通硅膠柱分離救必應(yīng)酸成分，減少展開劑使用，工藝更簡單；回流提取過程采用17%甲醇代替30%乙醇。本研究是通過救必應(yīng)提取純化制備救必應(yīng)酸單體作為研究對象，意在開發(fā)救必應(yīng)酸這一單體藥物（化學(xué)1.1類新藥），提取工藝研究中使用的甲醇。將在后續(xù)制備產(chǎn)品過程中檢查甲醇?xì)埩袅?，使之符合國家?guī)范。救必應(yīng)酸制備過程中篩選了不同的提取溶液。救必應(yīng)酸在甲醇中溶解度大，且在后續(xù)處理過程中在加入水后會析出救必應(yīng)酸，方便純化救必應(yīng)酸單體。另甲醇基本可以100%回收利用，符合環(huán)保的要求，故在制備中選用甲醇為提取液。

為改善色譜峰形狀，文獻(xiàn)[12]中采用了加入無機(jī)酸的方法。本文建立的RP-HPLC方法則將文獻(xiàn)中流速1.0 mL/min提高為1.2 mL/min，既能起到改善峰形作用，又能縮短分析時間，所有成分可在30 min內(nèi)完成含量測定。

采用精制工藝獲得的救必應(yīng)精制品作為純化救必應(yīng)酸的原料，在精制過程中通過堿水解、抗溶劑化結(jié)晶方法去除紫丁香苷成分，所以精制品中紫丁香苷成分含量為0。雖然長梗冬青苷和救必應(yīng)酸的含量因精制工藝而明顯不同，但是工藝穩(wěn)定性很好。大多數(shù)研究多以紫丁香苷、長梗冬青苷兩種成分的含量評價救必應(yīng)藥材及其制劑的質(zhì)量[1，14-15]。救必應(yīng)酸作為藥材中治療心血管疾病的活性成分，且為長梗冬青苷在體內(nèi)的水解產(chǎn)物，因此也應(yīng)控制其在救必應(yīng)藥材及其制劑中的含量。2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定救必應(yīng)藥材中紫丁香苷、長梗冬青苷含量不得少于1.0%、4.5%，并未規(guī)定救必應(yīng)酸的含量。不同產(chǎn)地救必應(yīng)藥材中救必應(yīng)酸的含量差別大，所以設(shè)定藥材和制劑中救必應(yīng)酸含量的最低限度還需大量測定不同產(chǎn)地救必應(yīng)藥材，并依據(jù)藥材或制劑的藥效確定。本研究建立的RP-HPLC法滿足同時測定紫丁香苷、長梗冬青苷、救必應(yīng)酸含量的需要，方法快速準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為救必應(yīng)藥材和制劑的質(zhì)量控制提供了科學(xué)的依據(jù)。

本試驗尚未比較經(jīng)不同的提取精制工藝后長梗冬青苷、救必應(yīng)酸的含量變化，下一步計劃設(shè)計多種工藝比較二者的含量差異；另外，計劃通過體內(nèi)外試驗探討救必應(yīng)酸單體在治療心血管疾病方面的活性，為開發(fā)救必應(yīng)酸單體藥物奠定試驗基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S]. 2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：312-313.

[ 2 ] 董艷芬，梁燕玲，羅集鵬.救必應(yīng)不同提取物對血壓影響的實驗研究[J].中藥材，2006，29（2）：172-174.

[ 3 ] 譚曉斌，賈曉斌，沈明勤，等.結(jié)合藥效的刺五加純化工藝優(yōu)選[J].中國藥房，2007，18（12）：902-904.

[ 4 ] 趙全成.救必應(yīng)藥物組合物及其用途：中國，201010607- 550.1[P]. 2011-06-01.

[ 5 ] LEE TH，JUANG SH，HSU FL，et al. Triterpene acids fr- om the leaves of planchonella duclitan （Blanco） Bakhuizan [J]. J Chin Chem Soc，2005，52（6）：1275-1280.

[ 6 ] 赫玉芳.救必應(yīng)酸的制備及其衍生物的設(shè)計、合成和抗腫瘤活性研究[D].長春：吉林大學(xué)，2013.

[ 7 ] 許睿.救必應(yīng)化學(xué)成分研究及抗腫瘤活性成分初步篩選 [D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2009.

[ 8 ] 張麗芬，劉志承，索娟，等.活血舒筋貼膏劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國藥房，2011，22（11）：1012-1014.

[ 9 ] 常艷茹，南敏倫，趙昱瑋，等.救必應(yīng)化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].黑龍江醫(yī)藥，2015，28 （1）：11-14.

[10] 黃聞健.救必應(yīng)的民間應(yīng)用[J].江西中醫(yī)藥，1996（2）：147.

[11] 顧利紅，畢福鈞，陳藹.不同來源救必應(yīng)藥材的質(zhì)量評價 [J].中草藥，2013，44（5）：622-625.

[12] 朱錦萍，楊寶，楊滔，等. HPLC法同時測定救必應(yīng)藥材中4種成分的含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2015，26（4）：558-560.

[13] NAKATANI M，HATANAKA S，KOMURA H， et al. The structure of rotungenoside，a new bitter triterpene glucoside from Ilex rotunda[J]. Bull Chem Soc Jpn，1989，62（2）：469-473.

[14] 王軍憲，張元媛，賈曉妮，等. HPLC法測定救必應(yīng)藥材中紫丁香苷的含量[J].藥物分析雜志，2008，28（5） ：788- 789.

[15] 王曉博，張俏，曹愛蘭，等.鐵冬青不同產(chǎn)地不同部位質(zhì)量分析[J].中南藥學(xué)，2016，14（7）：728-730.

（收稿日期：2017-04-05 修回日期：2017-11-30）

（編輯：余慶華）