五酯膠囊/五味子酯甲和環(huán)磷酰胺聯(lián)合給藥對大鼠體內(nèi)環(huán)磷酰胺藥動(dòng)學(xué)的影響研究

馮格　翟健秀　陳萬生　高守紅　張鳳　熊筱娟

中圖分類號 R969.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）03-0307-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.03.05

摘 要 目的：研究五酯膠囊（WZC）/五味子酯甲（SchA）和環(huán)磷酰胺聯(lián)合給藥對大鼠體內(nèi)環(huán)磷酰胺（CTX）藥動(dòng)學(xué)的影響。方法：36只大鼠隨機(jī)分為CTX組（尾靜脈注射CTX溶液300 mg/kg），CTX+WZC組（灌胃五酯膠囊300 mg/kg+尾靜脈注射CTX溶液300 mg/kg），CTX+SchA低、中、高、極高劑量組（灌胃SchA 30、300、3 000、30 000 μg/kg+尾靜脈注射CTX溶液300 mg/kg），每組6只。分別于給藥前及給藥后0.083、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、36、48 h自眼眶靜脈叢取血0.3 mL，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定大鼠血漿中CTX及其代謝產(chǎn)物[脫氯乙基環(huán)磷酰胺（DC-CTX）、4-酮基環(huán)磷酰胺（4-keto CTX）、羧基磷酰胺（CPM）]的質(zhì)量濃度，繪制藥-時(shí)曲線，并用DAS 2.0軟件擬合藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果：CTX組，CTX+WZC組，CTX+SchA低、中、高、極高劑量組大鼠血漿中DC-CTX的cmax分別為（22 167.85±2 844.93）、（10 920.53±1 490.89）、（18 951.29±1 558.81）、（18 622.08±791.19）、（18 515.20± 2 560.61）、（15 133.21±1 305.07） μg/mL，AUC0-48 h分別為（173 864.01±65 342.21）、（100 996.98±33 530.02）、（137 028.16± 45 975.19）、（131 650.18±53 196.41）、（113 699.40±34 131.36）、（110 773.27±30 307.15） μg·mL/h；與CTX組比較，CTX+WZC組，CTX+SchA低、中、高、極高劑量組大鼠血漿中DC-CTX的cmax分別降低50.74%、14.51%、16.10%、16.48%、31.73%，AUC0-48 h分別降低約42.23%、21.45%、24.63%、33.37%、36.55%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），t1/2、tmax等其余藥動(dòng)學(xué)指標(biāo)無明顯變化。結(jié)論：WZC與SchA均可在一定程度上降低DC-CTX的生成，表明二者可以抑制CTX毒性代謝途徑進(jìn)而減少毒性代謝產(chǎn)物氯乙醛的生成；但SchA對毒性代謝途徑的抑制作用弱于WZC，且不存在劑量依賴性。

關(guān)鍵詞 環(huán)磷酰胺；五酯膠囊；五味子酯甲；藥動(dòng)學(xué)；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of Wuzhi capsule/schisantherin A （SchA） combined with cyclophosphamide on the pharmacokinetics of cyclophosphamide （CTX） in rats. METHODS： A total of 36 rats were randomly divided into CTX group （via tail vein， iv， CTX solution 300 mg/kg）， CTX+WZC group （ig， Wuzhi capsule 300 mg/kg+via tail vein， iv， CTX solution 300 mg/kg）， CTX+SchA low-dose， medium-dose， high-dose and excessive high-dose groups （ig， SchA 30， 300， 3 000， 30 000 μg/kg+via tail vein， iv， CTX solution 300 mg/kg） with 6 rats in each group. Blood samples were collected from orbital venous plexus of rats before medication and 0.083， 0.25， 0.5， 1， 2， 3， 4， 6， 8， 12， 24， 36， 48 h after medication. UPLC-MS/MS method was applied for concentration determination of CTX and its metabolites [de-chloroethyl CTX （DC-CTX）， 4-ketone CTX （4-keto CTX）， carboxyl phosphamide （CPM）] in plasma of rats. The plasma concentration-time curve was obtained. The pharmacokinetic parameters were fitted by using DAS 2.0 software. RESULTS： The maximum plasma concentration （cmax） of DC-CTX in CTX group， CTX+WZC group， CTX+SchA low-dose， medium-dose， high-dose and excessive high-dose groups were （22 167.85±2 844.93），（10 920.53±1 490.89），（18 951.29±1 558.81），（18 622.08±791.19），（18 515.20±2 560.61）， （15 133.21±1 305.07） μg/mL， respectively； the area under the curves （AUC0-48 h） were （173 864.01±65 342.21）， （100 996.98±33 530.02），（137 028.16±45 975.19）， （131 650.18±53 196.41），（113 699.40±34 131.36）， （110 773.27±30 307.15） μg·mL/h， respectively. Compared with CTX group， cmax of DC-CTX in CTX group， CTX+SchA low-dose， medium-dose， high-dose and excessive high-dose groups were decreased by 50.74%， 14.51%， 16.10%， 16.48%， 31.73%， respectively. AUC0-48 h were decreased by about 42.23%， 21.45%， 24.63%， 33.37%， 36.55%， respectively； with statistical significance （P<0.05）. The pharmacokinetic indexes as t1/2， tmax had no significant change. CONCLUSIONS： To some degree， both WZC and SchA can reduce the generation of DC-CTX， which indicates both of them can inhibit CTX toxicity metabolism pathway so as to reduce the generation of toxic metabolite chloroacetaldehyde. The inhibitory effect of SchA on toxicity metabolism pathway is weaker than that of WZC， and does not have a dose-dependent inhibitory effect.

KEYWORDS Cyclophosphamide； Wuzhi capsule； Schizander A； Pharmacokinetics； Rats

高劑量環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）是常用于多發(fā)性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）治療的自體外周血造血干細(xì)胞動(dòng)員方案，但同時(shí)會引起嚴(yán)重的毒副作用，且大多與CTX代謝過程相關(guān)。CTX為前藥，在體外無活性，進(jìn)入體內(nèi)后在細(xì)胞色素P450（CYP）酶的作用下發(fā)揮作用，但在CYP3A4的作用下生成具有腎毒性和神經(jīng)毒性的氯乙醛，同時(shí)會生成等物質(zhì)的量的脫氯乙基環(huán)磷酰胺（Dechloroethylcyclophosphamide，DC-CTX）[1]。由于CTX是前藥，需要代謝才能產(chǎn)生活性成分磷酰胺氮芥，且目前尚無研究認(rèn)為測定其血漿濃度能夠完全反映CTX的藥理活性。因此，大多數(shù)研究會檢測其活性代謝通路上較為穩(wěn)定的化合物4-酮基環(huán)磷酰胺（4-ketocyclophosphamide，4-keto CTX）和羧基磷酰胺（Carboxyethylphosphoramide，CPM）的含量，同時(shí)結(jié)合CTX的血藥濃度水平反映CTX的活性轉(zhuǎn)化的情況。五酯膠囊（Wuzhi capsule，WZC）是南五味子（即華中五味子）的提取物，本課題組前期及相關(guān)研究均表明其對CYP3A4具有抑制作用，且可以通過CTX聯(lián)用WZC降低CYP3A4代謝通路中DC-CTX的生成從而降低毒性反應(yīng)[1-2]。五味子酯甲（Schisantherin A，SchA）是WZC中含量較高的成分之一，具有抑制肝竇內(nèi)皮細(xì)胞功能及血管新生的活性，同時(shí)具有抗氧化功效，主要用于治療慢性肝炎[2]。

2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定了SchA含量在南五味子中不得低于0.20%[3]，而WZC僅將五味子甲素作為其質(zhì)量控制化合物。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，SchA在WZC中含量較高，僅略低于五味子甲素，不同產(chǎn)地南五味子藥材中SchA含量相差最高約5倍，在同一廠家出產(chǎn)的藥品制劑中相差約2倍[2]，而SchA作為南五味子藥材及WZC中對CYP3A的抑制作用最強(qiáng)的化合物，其含量的高低對WZC產(chǎn)生的CYP3A抑制作用可能有關(guān)聯(lián)[2]。除此以外，目前尚無文獻(xiàn)考察SchA與CTX聯(lián)合使用的研究，因此有必要考察SchA和CTX聯(lián)合使用時(shí)對CTX毒性代謝產(chǎn)物生成的影響，為WZC的臨床合理應(yīng)用和二次開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

6460超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-MS/MS，美國 Agilent公司）；VX-200漩渦混合儀（美國Labnet公司）；5810R低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。

1.2 藥品與試劑

DC-CTX（批號：D226400，純度：96.0%）、CPM（批號：C181350，純度：96.0%）、4-keto CTX（批號：O849900，純度：98.0%）對照品均購自加拿大TRC公司； CTX對照品（美國Sigma-Aldrich公司，批號：079K1569，純度：99.0%）；替硝唑（TNZ）對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：10036-200703，純度：98%）；CTX粉針（德國Boxer公司，批號：5A047B，規(guī)格：每瓶 0.2 g）；美司鈉注射液（德國Baxter Oncology GmbH公司，批號：4A177A，規(guī)格：4.0 mL ∶ 0.4 g）； WZC（四川禾正制藥有限責(zé)任公司，批號：150912，規(guī)格：每粒含五味子甲素11.25 mg）； SchA（上海長征醫(yī)院制劑室自制，結(jié)構(gòu)通過波譜鑒定，批號：20150716，純度：99.0%）；甲醇為色譜純，其余為分析純，水為純化水。

1.3 動(dòng)物

清潔級健康SD大鼠36只，♂，體質(zhì)量（220±30） g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2007-0005。

2 方法與結(jié)果

2.1 動(dòng)物分組及給藥

36只大鼠隨機(jī)分為CTX組[尾靜脈注射CTX溶液（每0.2 g CTX加生理鹽水5 mL溶解所得溶液）300 mg/kg]，CTX+WZC組（灌胃WZC 300 mg/kg+尾靜脈注射CTX溶液300 mg/kg），CTX+SchA低、中、高、極高劑量組（灌胃SchA 30、300、3 000、30 000 μg/kg+尾靜脈注射CTX溶液300 mg/kg），每組6只。各組大鼠灌胃給藥15 min后注射給藥。

2.2 血漿樣品的采集及樣品前處理

各組大鼠注射給藥結(jié)束后1 h于尾靜脈注射美司鈉注射液（劑量為CTX劑量的1.4倍，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定）進(jìn)行CTX所致尿道損傷的保護(hù)，分別于給藥后0.083、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、36、48 h自大鼠眼眶靜脈叢取血約0.3 mL，置于1.5 mL肝素化的離心管中，混勻，離心（離心半徑為10 cm，6 000 r/min）5 min，取上清液， -20 ℃冰箱中保存。血漿融化后，取30 μL，加生理鹽水870 μL、渦旋30 s，取樣品100 μL于1.5 mL離心管中，加入含內(nèi)標(biāo)TNZ（6 ng/mL）的乙腈溶液400 μL，渦旋1.5 min、混勻、離心（離心半徑為6 cm，14 000 r/min）15 min，取100 μL上清液，加入10%乙腈溶液400 μL，渦旋30 s、離心（離心半徑為6 cm，14 000 r/min）5 min，取上清液，進(jìn)樣測定。

2.3 大鼠血漿中CTX及其代謝產(chǎn)物方法學(xué)考察

大鼠血漿中CTX及其代謝產(chǎn)物CPM、4-keto CTX、DC-CTX的測定是基于課題組前期建立的方法[1]。

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent poroshell SB-C18（75 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相：10 mmol/L醋酸銨溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～0.5 min，10%～15%B；0.5～0.6 min，15%～30%B；0.6～3.7 min，30%～90%B）；流速：0.25 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源參數(shù)：電噴霧離子源（ESI）；鞘流氣：350 ℃，12 L/min；干燥氣：325 ℃，10 L/min；碰撞氣壓力：40 psi（1 psi=6.895 kPa）；毛細(xì)管電壓：4 000 V；監(jiān)測模式：多重反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）正離子模式；離子通道：CTX[M+H]+ m/z 261.10→140.10，毛細(xì)管出口電壓（F）：135 V，碰撞誘導(dǎo)解離電壓（CE）：22 eV；CPM[M+H]+ m/z 293.10→221.10，F(xiàn)：90 V，CE：15 eV；4-keto CTX[M+H]+ m/z 275.10→142.00，F(xiàn)：125 V，CE：27 eV；DC- CTX[M+H]+ m/z 199.20→78.00，F(xiàn)：120 V，CE：21 eV；內(nèi)標(biāo)TNZ[M+H]+ m/z 248.10→121.10，F(xiàn)：90 V，CE：14 eV。

2.3.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取“空白血漿+對照品”和“2.2”項(xiàng)下血漿樣品，按“2.3.1”“2.3.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，CTX、CPM、4-keto CTX、DC-CTX及內(nèi)標(biāo)TNZ的保留時(shí)間分別為3.29、2.20、2.75、2.35、2.38 min。UPLC-MS/MS圖見圖1。

2.3.4 線性關(guān)系考察 按照相關(guān)要求進(jìn)行操作，以待測物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL），待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

2.3.5 方法學(xué)考察 按照相關(guān)要求進(jìn)行操作。結(jié)果，CTX、CPM、4-keto CTX、DC-CTX穩(wěn)定性試驗(yàn)（室溫放置6 h；9 ℃放置24 h；常溫、-20 ℃反復(fù)凍融3次；-20 ℃凍存15 d）的RSD<10%（n=6），重復(fù)性試驗(yàn)的RSD<15%（n=6），精密度試驗(yàn)的RSD<15%（n=6），加樣回收率為66.44%～96.66%（RSD<10%，n=6），基質(zhì)效應(yīng)RSD<15%（n=6），均符合相關(guān)規(guī)定。

2.4 大鼠血漿樣品測定結(jié)果

大鼠按“2.1”項(xiàng)下方法分組及給藥，按“2.2”項(xiàng)下方法采樣并處理后，按“2.3.1”“2.3.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，CTX及其代謝產(chǎn)物在大鼠血漿中的藥-時(shí)曲線見圖2。

采用DAS 2.0藥動(dòng)學(xué)軟件進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)分析，結(jié)果見表2～表5。

由于毒性代謝產(chǎn)物氯乙醛生成量用等物質(zhì)量生成的DC-CTX的量表示，因此，DC-CTX血漿暴露量的減少表示聯(lián)用藥物對CTX側(cè)鏈代謝的CYP3A4酶具有抑制作用，使具有腎毒性的氯乙醛生成量減少[1，4]。采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用單因素方差分析法比較組間藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的差異性。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果，由表3可知，與CTX組比較，CTX+WZC組大鼠血漿中降低腎毒性指標(biāo)的DC-CTX的cmax顯著降低（P<0.05），即氯乙醛的量顯著減少，而在CTX+SchA低、中、高、極高劑量組DC-CTX的生成量雖有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），從而表明，WZC與SchA均可在一定程度上抑制CTX毒性代謝途徑，但單體成分SchA對毒性代謝途徑的抑制作用不如含有多個(gè)木酯素成分的WZC效果顯著。同時(shí)結(jié)果顯示，在CTX+SchA高劑量組CTX及其代謝產(chǎn)物的t1/2較其他給藥組顯著增加，此情況可能是由于大鼠個(gè)體差異引起的，但具體原因有待進(jìn)一步研究。

與CTX組比較，對于待測成分原藥CTX、CTX與WZC或SchA聯(lián)合給藥組的t1/2均延長，其中CTX+SchA高劑量組及極高劑量組具有顯著性差異（P<0.05），說明WZC與SchA減緩了藥物的消除，使藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間延長；對于代謝產(chǎn)物DC-CTX的CL，聯(lián)合給藥組均表現(xiàn)為增加，其中WZC組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），說明WZC可促進(jìn)毒性代謝產(chǎn)物在腎臟中的清除排泄，降低了藥物對腎臟的損害，SchA可能有此作用，但由于無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，需要進(jìn)一步研究加以驗(yàn)證。

3 討論

本研究是在課題組研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行的研究[1]，課題組前期工作主要有：通過體外酶孵育細(xì)胞試驗(yàn)證實(shí)WZC及SchA對CYP3A4具有抑制作用，且通過對WZC的主要成分進(jìn)行含量測定發(fā)現(xiàn)SchA含量相對較高，由此推測，SchA可能為WZC產(chǎn)生CYP3A4抑制作用的主要化合物；通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)WZC與CTX合并用藥后WZC可降低CTX引起的腎毒性；建立了高劑量給藥CTX后大鼠血漿中CTX及其代謝產(chǎn)物濃度的檢測方法[1-2]?；谝陨?，本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討并確定SchA是否為WZC抑制CTX腎毒性代謝產(chǎn)物生成的物質(zhì)基礎(chǔ)，從而為WZC的臨床合理用藥和二次開發(fā)提供基礎(chǔ)，實(shí)驗(yàn)方案對大鼠的給藥劑量亦是基于前期工作基礎(chǔ)設(shè)定：300 mg/kg的CTX給藥劑量是通過臨床上多發(fā)性骨髓瘤（MM）患者高劑量沖擊療法常用量換算而得；300 mg/kg的WZC給藥劑量是前期實(shí)驗(yàn)證明該劑量單次給藥對大鼠體內(nèi)CYP3A4活性抑制最強(qiáng)，且對CTX側(cè)鏈代謝抑制作用也最強(qiáng)[1]，該劑量下SchA的含量為30 μg/kg，由此設(shè)定了SchA的最低給藥劑量。而前期體外酶孵育細(xì)胞實(shí)驗(yàn)推導(dǎo)出SchA單個(gè)化合物發(fā)揮CYP3A4抑制作用的半數(shù)抑制濃度（IC50）值為300 μg/kg，參考最大給藥劑量為30 000 μg/kg，因此，SchA與CTX聯(lián)合用藥后CTX藥動(dòng)學(xué)考察中，SchA設(shè)置了低、中、高、極高劑量組，即30、300、3 000、30 000 μg/kg的給藥劑量，該給藥劑量設(shè)定的目的是通過不同劑量或不同組別間實(shí)驗(yàn)結(jié)果的對比分析，可以考察SchA的體內(nèi)CYP3A4抑制作用，并與其制劑WZC進(jìn)行比較。

本實(shí)驗(yàn)參考臨床給藥方案，對實(shí)驗(yàn)大鼠給予了美司鈉注射液進(jìn)行保護(hù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，WZC與SchA均可在一定程度上降低DC-CTX的生成，表明二者可以抑制CTX毒性代謝途徑進(jìn)而減少腎毒性代謝產(chǎn)物氯乙醛的生成；但SchA對毒性代謝途徑的抑制作用不如WZC顯著，且不存在劑量依賴性抑制效果，此與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相似[5-13]。由于SchA具有在南五味子或WZC中的木酯素含量相對較高、性質(zhì)穩(wěn)定、易于提取分離等特有的優(yōu)勢，所以對其進(jìn)行研究還是很有價(jià)值的。同時(shí)結(jié)果顯示，在CTX+SchA極高劑量組CTX及其代謝產(chǎn)物的t1/2較其他給藥組顯著延長，出現(xiàn)此情況的原因，可能是SchA在此劑量時(shí)對酶具有誘導(dǎo)作用[7-9]；或由于實(shí)驗(yàn)大鼠存在的個(gè)體差異對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)產(chǎn)生影響；或其他外在因素，具體緣由有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究首次考察了SchA和CTX聯(lián)合使用時(shí)對CTX及其代謝產(chǎn)物藥動(dòng)學(xué)行為影響，通過聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)確定了SchA對CYP3A4酶在一定程度上具有抑制作用，但不存在劑量依賴性抑制效果。由于SchA在南五味子提取物中含量相對較高且性質(zhì)穩(wěn)定，因此該成分有望被開發(fā)成為CYP3A4酶抑制劑，為WZC的二次開發(fā)提供基礎(chǔ)；同時(shí)也為進(jìn)一步對WZC對CTX減毒效果的研究提供基礎(chǔ)及參考依據(jù)，而筆者將在后續(xù)研究中對其他指標(biāo)進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2017-04-23 修回日期：2017-09-30）

（編輯：劉明偉）