芒柄花素包合物脂質體的制備及質量評價

廖燦城　郭波紅　許丹翹　吳秀君　易軍　黃澤賢

中圖分類號 R943 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）03-0303-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.03.04

摘 要 目的：制備芒柄花素（FMN）包合物脂質體，并評價其質量。方法：以薄膜分散法制備FMN包合物脂質體，考察所制脂質體的外觀形態(tài)、粒徑、Zeta電位、包封率以及體外釋放行為。結果：所制FMN包合物脂質體的粒徑為（255.34±12.87） nm、Zeta電位為（25.32±3.51） mV、包封率為（81.63±0.79）%（n=3）、24 h的累積釋放度為56.12%。結論：本方法成功制得具有良好緩釋效果的FMN包合物脂質體，且質量符合相關標準。

關鍵詞 芒柄花素；包合物；脂質體；質量評價

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare Formononetin （FMN） inclusion compound liposome and evaluate its quality. METHODS： FMN inclusion compound liposome was prepared by film dispersion method. The morphology， particle size， Zeta potential， encapsulation efficiency and in vitro release properties were studied. RESULTS： The particle size， Zeta potential and encapsulation efficiency of prepared FMN inclusion compound liposome were （255.34±12.87） nm， （25.32±3.51） mV， （81.63±0.79）%， respectively （n=3）. The 24 h accumulative release rate of prepared FMN inclusion compound liposome was 56.12%. CONCLUSIONS： FMN inclusion compound liposome with good sustained-release effect is prepared successfully and in line with related quality standard.

KEYWORDS Formononetin； Inclusion compound； Liposome； Quality evaluation

1994年，Mccormack B等[1]首次提出環(huán)糊精可應用于脂質體中。近年來，環(huán)糊精已廣泛應用于脂質體、納米粒等給藥體系中，上述給藥體系均可提高難溶性藥物的溶解度，改善藥物生物利用度，同時增加藥物的穩(wěn)定性以及減輕藥物的刺激性[2-3]。

芒柄花素（7-羥基-4′ -甲氧基異黃酮，F(xiàn)MN）是一種異黃酮類化合物，具有較好的抗腫瘤作用，目前該藥已被應用于乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、肺癌等治療，還被用于治療骨質疏松、改善婦女更年期癥狀等[4-9]。但該化合物在水中幾乎不溶，口服生物利用度低，極大限制了其臨床應用。

包合物脂質體給藥系統(tǒng)是結合了環(huán)糊精作為包合材料的優(yōu)點和脂質體作為優(yōu)良載體的緩釋靶向優(yōu)點的一種給藥系統(tǒng)[10]，其中環(huán)糊精能將水不溶性分子作為客分子包入其疏水性空腔形成水溶性包合物，但是當藥物包合物進入血液后迅速解離，所以包合物并不能控制藥物的體內行為；而用脂質體包封藥物包合物后可達到靶向和緩釋的效果，可以用來控制藥物在體內的清除速率及改變其組織分布等。本研究將環(huán)糊精包合物包封至脂質體載藥系統(tǒng)中，旨在制備一種給藥系統(tǒng)以提高脂質體包封率及其穩(wěn)定性，以達到改善FMN藥動學行為的目的。

1 材料

1.1 儀器

1200高效液相色譜（HPLC）儀（美國Agilent科技有限公司）；BS110S電子天平（德國Sartorius有限公司）；UV-1700紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；DelsaTM Nano C粒徑及Zeta電位分析儀（美國Beckman Coulter公司）；Hitachi H-7650透射電鏡（日本Hitachi公司）；透析袋（廣州齊云生物技術有限公司，截留分子量：8 000～14 000 Da）。

1.2 藥品與試劑

FMN對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111703-201504，純度：99.50%）；FMN原料藥（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：C-018-150728，純度：≥98%）；FMN包合物[廣東藥科大學藥學院實驗室自制，批號：160905，F(xiàn)MN載藥量：（9.42±0.25）%[11]]；蛋黃卵磷脂、膽固醇（上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司）；泊洛沙姆188（P188，安徽山河藥用輔料股份有限公司，批號：160310）；葡聚糖凝膠（Sephadex G-50，瑞典Pharmacia公司）；甲醇為色譜純，其余試劑為市售分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 FMN的含量測定方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Dikma Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液 （70 ∶ 30，V/V）；流速：1 mL/min；檢測波長：249 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.1.2 溶液的制備 （1）對照品溶液。精密稱取適量FMN對照品，加甲醇溶解，制成質量濃度為30 μg/mL的對照品貯備液。精密量取對照品貯備液2.0 mL，置于10 mL棕色量瓶中，用流動相稀釋定容制成質量濃度為6 μg/mL的溶液，作為對照品溶液。（2）供試品溶液。取“2.2.1”項下FMN包合物脂質體混懸液0.5 mL，置于10 mL量瓶中，加入適量甲醇破乳后，加流動相定容至刻度，經(jīng)0.45 ?m微孔濾膜過濾，得供試品溶液。（3）陰性對照溶液。取不含F(xiàn)MA的空白包合物脂質體混懸液0.5 mL，按“（2）”項下方法制成陰性對照溶液。

2.1.3 專屬性考察 取供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜。結果，在該色譜條件下，芒柄花素的出峰時間約為7.13 min，輔料和試劑對FMN的測定無干擾。色譜圖見圖1。

2.1.4 線性關系考察 精密制備質量濃度分別為0.75、1.5、3、6、12、24 μg/mL的FMN對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標（y）、質量濃度為橫坐標（x）進行線性回歸。得回歸方程為y=130.7x+16.272（r=0.999 9），結果表明，F(xiàn)MN在0.75～24 μg/mL質量濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.1.5 精密度試驗 取質量濃度為6 μg/mL的FMN對照品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣測定6次考察日內精密度；每天進樣測定1次，連續(xù)測定4 d考察日間精密度。結果顯示，日內RSD為0.28%（n=6），日間RSD為0.12%（n=4）。

2.1.6 準確度試驗 精密量取FMN脂質體供試品溶液0.5 mL，分別按已知0.5 mL供試品中FMN含量的0.8、1.0、1.2倍加入適量的FMN對照品溶液，共9份，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率。結果，平均加樣回收率為99.84%（RSD=0.36%，n=9）。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，在0、4、8、12、24、36、48、72 h，分別按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，峰面積的RSD為0.87%（n=8），表明供試品溶液在72 h內穩(wěn)定。

2.2 脂質體的制備

2.2.1 FMN包合物脂質體 采用薄膜分散法[12]制備FMN包合物脂質體。按質量比為10 ∶ 1精密稱取磷脂與膽固醇，溶于三氯甲烷，轉移至250 mL茄形瓶中，45 ℃恒溫水浴中減壓旋轉蒸發(fā)，形成均勻類脂薄膜，50 ℃真空干燥過夜；另將0.025 4 g FMN包合物溶于10 mL pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）中作為水化介質，加至茄形瓶中，再加入0.009 3 g P188，振搖，50 ℃恒溫水浴中水化40 min，水浴超聲（功率：200 W，超聲時間：3 s，間歇時間：3 s，下同）將類脂膜完全洗脫，即得FMN脂質體混懸液；再探頭超聲4 min，依次過0.45、0.22 μm濾膜整粒，即得FMN包合物脂質體，4 ℃保存。

2.2.2 FMN普通脂質體 取適量FMN原料藥，按“2.2.1”項下“按質量比為10 ∶ 1精密稱取磷脂與膽固醇”起開始操作，水化介質為10 mL pH 7.4的PBS，制備FMN普通脂質體。

2.3 包封率的測定

精密量取0.5 mL脂質體置于Sephadex G-50凝膠柱頂端，用pH 7.4 PBS洗脫，收集游離包合物組分，水浴蒸干，再用適量甲醇溶解，測定FMN的濃度并計算游離部分的藥量（mfree）；再取0.5 mL脂質體，加入適量甲醇充分振搖破乳，用流動相定容，測定FMN的濃度并計算總藥量（mtotal），根據(jù)下列公式計算包封率，包封率（%）= （mtotal-mfree）/mtotal×100%。按上述方法分別測定FMN普通脂質體與FMN包合物脂質體的包封率，平行測定3次，結果顯示，F(xiàn)MN普通脂質體的包封率為（5.38±1.46）%（n=3），F(xiàn)MN包合物脂質體的包封率為（81.63±0.79）%（n=3）。由此可見，F(xiàn)MN包合物脂質體可以顯著提高難以包入脂質體的藥物FMN的包封率。

2.4 脂質體形態(tài)觀察

取適量FMN包合物脂質體用pH 7.4的PBS稀釋后，點樣于銅網(wǎng)上，負染后用透射電鏡觀察形態(tài)并拍照。結果顯示，F(xiàn)MN包合物脂質體輪廓清晰，大體呈圓形或橢圓形，F(xiàn)MN包合物脂質體的透射電鏡圖見圖2。

2.5 粒徑與Zeta 電位的測定

取FMN包合物脂質體溶液適量，稀釋若干倍后，用粒徑及Zeta電位分析儀檢測其粒徑、多分散指數(shù)（PDI）和Zeta電位。結果顯示，F(xiàn)MN包合物脂質體的粒徑為（255.34±12.87） nm、PDI為0.29±0.03、Zeta電位為（25.32±3.51） mV（n=3），F(xiàn)MN包合物脂質體的粒徑和Zeta電位分布圖見圖3。

由圖3可知，F(xiàn)MN包合物脂質體的粒徑多在100 nm以下，而粒徑及Zeta電位分析儀檢查到的粒徑卻為（255.34±12.87） nm，這是由于電鏡觀察時，脂質體需在銅網(wǎng)上晾干，干燥過程中引起了脂質體收縮，因此電鏡照片上的脂質體粒徑小于粒徑及Zeta電位分析儀測得的粒徑。

2.6 體外釋藥考察

分別取FMN包合物溶液、FMN普通脂質體及FMN包合物脂質體各1 mL（均相當于FMN 0.55 mg），置于透析袋中，以pH 7.4 PBS 150 mL為釋放介質，于（37±1） ℃、100 r/min下恒溫攪拌。分別于0.5、1、2、3、5、7、10、12、24 h取樣3 mL，并立即補充等溫等量新鮮釋放介質。收集樣品按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，計算累積釋放度，繪制釋放曲線。3種樣品的體外釋藥曲線見圖4。

體外釋放結果顯示，F(xiàn)MN包合物溶液、FMN普通脂質體以及FMN包合物脂質體的釋放速率依次減慢，1 h累積釋放度分別為42.00%、20.54%、8.31%，24 h累積釋放度分別為88.30%、66.29%、56.12%。表明與FMN包合物溶液和FMN普通脂質體比較，F(xiàn)MN包合物脂質體具有明顯的緩釋作用。

2.7 穩(wěn)定性考察

取FMN包合物脂質體混懸液，置于（4±2） ℃留樣觀察，考察穩(wěn)定性。結果顯示，F(xiàn)MN包合物脂質體在（4±2） ℃條件下放置3個月后，外觀未發(fā)生變化，其包封率、粒徑、Zeta電位分別為（80.16±0.39）%、（260.21±11.62） nm、（25.47±3.18） mV（n=3），表明其并未發(fā)生明顯改變，由此可以看出FMN包合物脂質體在低溫下放置3個月具有較好的穩(wěn)定性。

3 討論

通常對于親脂性特別強或親水性特別強[油-水分配系數(shù)的對數(shù)（lgP）>4.5或lgP<-0.3]的藥物比較容易制備成脂質體，而其他藥物難以包入脂質體，即使包封進脂質體后，將傾向于較迅速的滲漏[13]。因FMN在水中的平衡溶解度為（2.079±0.036） μg/mL，在正辛醇-水體系中的表觀油水分配系數(shù)lgP=2.79±0.03（37 ℃下測得，相關數(shù)據(jù)另文發(fā)表），對于這類藥物可以嘗試將其制成包合物后再制備脂質體。預試驗中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MN很難直接包入脂質體，其包封率僅為5.38%左右。制成包合物后再包入脂質體，其包封率可達80%以上。

預試驗中，筆者以包封率為評價指標，比較了薄膜分散法、乙醇注入法、逆相蒸發(fā)法3種制備方法，結果用乙醇注入法、逆相蒸發(fā)法制備的FMN包合物脂質體的包封率僅達58.60%和50.35%，因此選擇包封率高（81.63%）的薄膜分散法制備FMN包合物脂質體。

根據(jù)文獻[14]，由于該制劑處方中加入環(huán)糊精，可能會破壞磷脂雙層膜，并且膽固醇用量較小，對磷脂雙層膜的穩(wěn)定作用下降，故在處方中加入少量P188可能對脂質體混懸液有穩(wěn)定作用，且一般不顯著影響各項指標。預試驗中考察了加 P188的包合物脂質體和未加P188的包合物脂質體混懸液的穩(wěn)定性，結果表明，未加P188的包合物脂質體混懸液在4 ℃冰箱中保存2周后出現(xiàn)磷脂聚集現(xiàn)象，加P188的包合物脂質體在4 ℃冰箱中可保存3個月。

體外釋藥試驗結果表明，F(xiàn)MN包合物溶液體外釋放速度最快、包合物脂質體的釋放速度最慢，包合物脂質體釋放速度慢的原因可能是：包合物脂質體中的藥物經(jīng)過環(huán)糊精包合后被包載在脂質體的內水相，藥物釋放有兩個過程，第一個過程是以包合物的形式從脂質體中釋放，第二個過程是藥物從包合物中釋放[15]，所以釋放速度比包合物溶液和普通脂質體慢。

本研究制備了性質穩(wěn)定且有較高包封率的FMN包合物脂質體，且具有良好的緩釋效果，質量也符合相關標準。

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（收稿日期：2017-08-10 修回日期：2017-10-24）

（編輯：鄒麗娟）