微小RNA-499對(duì)心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

謝依諾，吳 丹，時(shí)向民，郭紅陽，林 琨，國(guó)建萍，苑洪濤，王玉堂，單兆亮

1解放軍總醫(yī)院 心內(nèi)科，北京 100853；2昆山宗仁卿紀(jì)念醫(yī)院 心內(nèi)科，江蘇昆山 215300

充血性心力衰竭(心衰)是一種復(fù)雜、多因素的疾病，是多種心臟疾病發(fā)展的最終階段，是心血管疾病中導(dǎo)致死亡率、住院率高的首要原因[1-2]。如今心室快速起搏制作心衰動(dòng)物模型在心衰機(jī)制研究中的應(yīng)用已被認(rèn)可[3]，多選用犬、豬等大型動(dòng)物[4]。隨著基因技術(shù)的發(fā)展，心肌細(xì)胞凋亡靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和基因轉(zhuǎn)染成功率的提高，基因治療難治性心衰成為一個(gè)重要的途徑。在基礎(chǔ)研究中，由于病毒載體的高昂價(jià)格，體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染往往只用于大鼠、小鼠等小型動(dòng)物。以SD大鼠作為快速起搏心室致心力衰竭模型為充血性心力衰竭的基因治療研究提供了一種更為適合的動(dòng)物模型[5]。衰竭的心臟組織中存在心肌細(xì)胞的凋亡，而凋亡又可使工作心肌細(xì)胞數(shù)量絕對(duì)減少進(jìn)而導(dǎo)致心肌收縮力下降。細(xì)胞凋亡的過程伴隨甚至早于心衰出現(xiàn)，并在心衰進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用[6]。有研究證實(shí)在體外心肌細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)中，miR-499具有促進(jìn)向心肌細(xì)胞分化增殖的作用，在細(xì)胞分化晚期可檢測(cè)到miR-499的高表達(dá)[7]。目前有研究表明，PDCD4和PACS2的表達(dá)增加可通過線粒體途徑促進(jìn)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡[8-9]，且miR-499在缺血性心衰過程中可以通過調(diào)節(jié)兩者的表達(dá)水平來抑制心肌細(xì)胞的凋亡[10]，但非缺血性心衰中參與凋亡的病理生理機(jī)制及miR-499對(duì)凋亡的保護(hù)機(jī)制尚不明了。我們通過轉(zhuǎn)染腺相關(guān)病毒使快速起搏致心衰大鼠的miR-499表達(dá)上調(diào)，并檢測(cè)miR-499、PDCD4、PACS2的表達(dá)水平的改變，進(jìn)而探討miR-499的過表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響。

材料和方法

1 材料 雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量(300±10) g，由解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；3%戊巴比妥鈉(解放軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供)；埋藏式動(dòng)物起搏器(上海復(fù)旦大學(xué)電子工程系提供)；電極導(dǎo)線(自制)；呼吸機(jī)(型號(hào)：HX-200成都泰盟科技有限公司)；多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(RM6240CD型，成都儀器廠)；Siemens Sequoia 512超聲診斷儀(探頭型號(hào)：15L8)；小型動(dòng)物手術(shù)臺(tái)；手術(shù)器械。

2 構(gòu)建rno-miR-499腺病毒相關(guān)載體及空載體及其AAV-9型病毒包裝 根據(jù)大鼠miR-499基因序列設(shè)計(jì)miRNA，Invitrogen公司合成miRNA片段，下劃線部分為BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。rnomiR-499-F：GATCCGCTGTTAAGACTTGCAGTGAT GTTTAGCTCCTCTCCATGTGAACATCACAGCAAGTC TGTGCTGCG；rno-miR-499-R：AATTCGCAGCAC AGACTTGCTGTGATGTTCACATGGAGAGGAGCTAA ACATCACTGCAAGTCTTAACAGCG；分別用100μl退火B(yǎng)uffer充分溶解合成DNA片段。分別對(duì)應(yīng)各取2μl DNA引物片段，加入至16μl退火B(yǎng)uffer中，充分混勻，100℃退火自然冷卻至室溫。退火產(chǎn)物分別用無菌水稀釋100倍。載體pAAV-ZsGreenmiRNA用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ+EcoRⅠ雙酶切。瓊脂糖凝膠回收酶切大片段。將質(zhì)粒pAAVZsGreen-miRNA回收大片段與rno-miR-499的稀釋退火產(chǎn)物連接，經(jīng)過一系列處理后，用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒。挑取菌落送測(cè)序，測(cè)序引物為ZsGreen-F。挑選鑒定正確的克隆。用高效轉(zhuǎn)染試劑盒(HETKit)將病毒載體導(dǎo)入293AAV細(xì)胞，48 h后從濾過的上清液中收集AAV顆粒，未經(jīng)限制性內(nèi)切酶切切割的載體pAAV-ZsGreenmiRNA(pAAV-NC)可作為空載體組的轉(zhuǎn)染。

3 動(dòng)物分組及處理 大鼠隨機(jī)分為4組(n=6)：1)假手術(shù)組(Sham group)；2)假手術(shù)+miR-499組(Sham+miR-499 group)；3)起搏+空載體組(Pacing+NC group)；4)起搏 +MiR-499組 (Pacing+miR-499 group)。各組大鼠均行起搏器及電極置入術(shù)(具體步驟參見本人已發(fā)表文章[5])，其中上調(diào)miR-499組別(2、4組)大鼠在右心室心尖部縫合電極后，于左心腔內(nèi)注射滴度為1×1012vg/ml病毒200μl，同時(shí)夾閉主動(dòng)脈10 s使病毒在心臟收縮的基礎(chǔ)上經(jīng)冠狀動(dòng)脈均勻轉(zhuǎn)染至心肌組織[11]，余操作同前。所有手術(shù)組術(shù)后每日腹腔注射青霉素200 000 U 7 d。需要起搏的組別(3、4組)術(shù)后5 d開始間斷打開起搏器開關(guān)，術(shù)后7 d開始以550/min頻次快速持續(xù)起搏4周，假手術(shù)組(1、2組)不進(jìn)行起搏處理。

4 心功能檢測(cè) 1)心臟超聲檢查：停止起搏后，3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔麻醉，記錄心率，用超聲心動(dòng)圖測(cè)定左心室射血分?jǐn)?shù)、左心室短軸縮短率。2)血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)采用多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)：麻醉下經(jīng)右頸外動(dòng)脈，插管至左心室，測(cè)定左心室舒張末壓、左心室收縮末壓及左心室壓力微分。

5 病理檢查 完成以上檢查后處死動(dòng)物，迅速取出心臟并稱重；沿左心室冠狀切面取心肌組織，進(jìn)行HE染色、TUNEL染色后光鏡檢查。

6 qRT-PCR檢測(cè)miR-499的mRNA水平 血流動(dòng)力學(xué)檢查結(jié)束后，快速取出處死大鼠心臟，0.9%氯化鈉注射液清洗后放入-80℃冰箱保存。抽提總RNA：取少量左心室游離壁心肌組織，加入1 ml Trizol溶液使用組織研磨器將心肌組織研碎，收集心肌組織溶液，吹打混勻，使細(xì)胞充分裂解，靜置5 min；加入200μl氯仿，劇烈振蕩混勻30 s，使水相和有機(jī)相充分接觸，室溫靜置2 min；4℃下，14 000 r/min離心15 min，RNA在上層水相，移至另一個(gè)新的RNasefreeEP管；加入等體積的異丙醇，輕柔地充分混勻，室溫靜置10 min沉淀RNA；4℃下，14 000 r/min離心10 min，收集RNA沉淀，去上清；用75%乙醇洗滌兩次，超凈臺(tái)風(fēng)干；加入15 ～ 60μl DEPC水溶解沉淀。檢測(cè)總RNA的純度和完整性。使用頸環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄RNA，合成cDNA。從GeneBank中查找SD大鼠miR-499的序列，用Premier Primer軟件設(shè)計(jì)引物，U6為內(nèi)參基因。rno-miR-499-5p上游引物：TTAAGACTTGCAGTG ATGTTT；U6-F上游引物：CTCGCTTCGGCAGCACA；U6-R下游引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT；按照說明書，用ABI Prism 7000(Applied Biosystems)滲入法配制反應(yīng)液、行PCR循環(huán)。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μl，2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化己啶染色，紫外線激發(fā)后凝膠成像儀照相。

7 Western blot檢測(cè)PDCD4與PACS2的蛋白表達(dá)水平 4℃下用含有蛋白酶抑制劑混合物的裂解緩沖液裂解心肌組織或心肌細(xì)胞1 h。獲得的蛋白樣品以Bradford比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。配制SDSPAGE凝膠，在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱5 min。冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，恒壓電泳90 ～ 120 min。轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，膜用麗春紅染色。用Western洗滌液漂洗1 ～ 2 min，洗去轉(zhuǎn)膜液。加入Western封閉液，室溫封閉60 min。吸盡封閉液，立即加入稀釋好的PDCD4一抗，室溫孵育1 h?；厥找豢?，加入Western洗滌液，搖動(dòng)洗滌5 ～ 10 min，共洗滌3次。吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫孵育1 h?；厥斩梗尤隬estern洗滌液，搖動(dòng)洗滌5 ～10 min，共洗滌3次。抗原抗體復(fù)合物用ECL類試劑檢測(cè)，蛋白帶的密度用光密度法測(cè)量，計(jì)算與肌動(dòng)蛋白的光密度的比率，對(duì)照組的比率設(shè)為1。

8 TUNEL法檢測(cè)心肌組織細(xì)胞凋亡 取左心室游離壁0.5 cm3組織塊用石蠟包埋，54μm連續(xù)切片，常規(guī)HE染色與TUNEL標(biāo)記染色。切片常規(guī)脫蠟水化，將燒杯盛200 ml的0.01 mol/L、pH 6.0的檸檬酸緩沖液，加熱至90 ～ 95℃迅速放入切片，加入雙蒸水(20 ～ 25℃)80 ml迅速冷卻，將玻片用PBS(20 ～ 25℃)洗3次；加20%正常牛血清室溫放置30 min；將TUNEL反應(yīng)混合液加在切片上，37℃溫育90 min；用PBS洗3次；用3% H2O2甲醇液室溫阻斷10 min；37℃溫育90 min，加POD轉(zhuǎn)化劑37℃溫育30 min；用PBS洗3次每次5 min DAB/H2O2顯色；蘇木素淡染，常規(guī)脫水，透明中性樹膠封固。光學(xué)顯微鏡下觀察。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 心功能檢測(cè) 心臟超聲及血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)：相較于Sham組，Pacing+NC組的左心室射血分?jǐn)?shù)、左心室短軸縮短率、左心室壓力微分均顯著降低；而Pacing+miR-499組上述指標(biāo)較Pacing+NC組有所回升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。相較于Sham組，Pacing+NC組大鼠的心率及左心室舒張末壓均有顯著升高，而Pacing+miR-499組上述指標(biāo)較Pacing+NC組有所降低(P＜0.05)。見表1。

2 qRT-PCR檢測(cè)各組大鼠心肌組織miR-499的mRNA水平 未注射miR-499腺相關(guān)病毒的組別(Sham組和Pacing+NC組)相較于注射miR-499腺相關(guān)病毒的組別(Sham+miR-499組和Pacing+miR-499組)，后者心肌組織內(nèi)miR-499的表達(dá)顯著增加 (圖 1)。

圖 1 各組大鼠的心肌組織miR-499表達(dá)水平的qRT-PCR法檢測(cè)結(jié)果(aP＜0.01)Fig. 1 MiR-499 expression of myocardium in rats by qRT-PCR(aP＜0.01)

表1 心臟超聲及血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果Tab. 1 Echocardiographic and hemodynamic results

3 Western blot檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞PDCD4與PACS2的蛋白表達(dá)水平 Western blot檢測(cè)結(jié)果可見，相較于Sham組，Pacing+NC組大鼠心肌組織PDCD4和PACS2的表達(dá)水平明顯升高。相較于Pacing+NC組，Pacing+miR-499組大鼠心肌組織PDCD4和PACS2的表達(dá)水平降低(圖2)。同時(shí)，我們根據(jù)對(duì)Western blot的結(jié)果做了半定量灰度分析(圖3)。說明miR-499的上調(diào)可使快速起搏致心衰大鼠的PDCD4和PACS2表達(dá)降低。

圖 2 各組大鼠的心肌PDCD4及PACS2蛋白表達(dá)水平(蛋白印跡法)Fig. 2 Expression of PDCD4 and PACS2 protein in rat myocardium by western blot

圖 3 各組大鼠的心肌PDCD4及PACS2蛋白表達(dá)水平的蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果的半定量灰度分析柱狀圖(aP＜0.01, bP＜0.05)Fig. 3 Semi-quantitative grayscale analysis of expression of PDCD4 and PACS2 protein in rat myocardium by western blot (aP＜0.01, bP＜0.05)

圖 4 各組大鼠心肌組織切片HE染色 (×400)Fig. 4 HE staining images of rat myocardial tissue section (×400)

圖 5 各組大鼠心肌組織切片TUNEL染色 (×400)Fig. 5 TUNEL staining images of rat myocardial tissue section (×400)

4 MiR-499對(duì)心衰大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響 大鼠于處死后迅速取出心臟沿左心室冠狀切面取左心室心肌組織，進(jìn)行HE染色后光鏡檢查，結(jié)果顯示假手術(shù)組及假手術(shù)+miR-499組心肌細(xì)胞形態(tài)正常，輪廓清晰，纖維排列整齊、橫紋清晰，無病理改變。起搏組可見心肌細(xì)胞水腫、有些心肌細(xì)胞出現(xiàn)脂肪樣變性、間質(zhì)充血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、心肌纖維排列紊亂，上調(diào)miR-499的起搏組大鼠心肌組織上述情況減輕(圖4)。取左心室游離壁0.5 cm3組織塊用石蠟包埋，54μm連續(xù)切片，TUNEL標(biāo)記染色(圖5)，并制作半定量柱狀圖(圖6)。切片結(jié)果肉眼可見Pacing+NC組大鼠心肌組織中出現(xiàn)大量被染至深褐色的TUNEL陽性細(xì)胞，而Sham組及Sham+miR-499組大鼠心肌細(xì)胞中肉眼幾乎不可見上述病理改變，上調(diào)miR-499表達(dá)的起搏組凋亡小體數(shù)量較起搏組明顯減少。柱狀圖結(jié)果更明顯直觀地反映出上述改變，起搏組細(xì)胞TUNEL陽性細(xì)胞率明顯高于Sham組及Sham+miR-499組，說明快速起搏刺激可促使動(dòng)物模型心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，同時(shí)Pacing+miR-499組的TUNEL陽性細(xì)胞率明顯低于Pacing+NC組，說明上調(diào)miR-499的表達(dá)可顯著抑制快速起搏刺激后心衰動(dòng)物模型心肌組織的凋亡(P＜0.05)。

圖 6 各組大鼠心肌組織切片TUNEL染色半定量分析心肌細(xì)胞凋亡率(aP＜0.01)Fig. 6 Semi-quantitative analysis of cardiomyocyte apoptosis rate in rat cardiac slices by TUNEL staining (aP＜0.01)

討 論

在本研究中，我們成功建立了心室快速起搏致心衰大鼠模型，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)：1)心室快速起搏可以使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)miR-499表達(dá)水平顯著降低，凋亡增加，并出現(xiàn)心衰。2)上調(diào)miR-499的表達(dá)，可以減輕心肌細(xì)胞凋亡，說明miR-499在快速起搏致心衰大鼠動(dòng)物模型中具有抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用，在快速起搏致心衰的大鼠模型中，持續(xù)快速的心室起搏可致心室重構(gòu)及室壁應(yīng)力的增加。

相關(guān)文獻(xiàn)顯示，PDCD4可通過影響eIF4A和eIF4G的翻譯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[8,12]。一些體外的研究也表明，在缺乏PDCD4的胰島素β細(xì)胞中，促凋亡基因水平降低而抗凋亡基因的水平增加[13]。PACS2也是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)因子，它可以加速線粒體死亡通路激動(dòng)子的移位[14-15]。同時(shí)，我們成功建立了快速起搏致心衰的大鼠模型來探究miR-499在非缺血性心衰的抗凋亡作用，實(shí)驗(yàn)過程中我們發(fā)現(xiàn)快速起搏致心衰大鼠模型的心肌細(xì)胞凋亡率與其他動(dòng)物模型(如狗，豬)基本一致[9,16]，本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，在感染AAV-miR-499后，起搏致心衰大鼠模型中過表達(dá)的miR-499可通過降低PDCD4和PACS2.的表達(dá)來降低心肌細(xì)胞的凋亡率。

本實(shí)驗(yàn)具有局限性，對(duì)于下調(diào)miR-499的表達(dá)是否會(huì)使快速起搏致心衰動(dòng)物模型的心肌細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增加未進(jìn)行更全面的印證，此外現(xiàn)階段未對(duì)心衰過程中神經(jīng)體液因子水平的變化進(jìn)行深入的研究。

本研究結(jié)果表明，上調(diào)miR-499的表達(dá)可顯著抑制快速起搏致心衰大鼠心肌細(xì)胞的凋亡。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)PDCD4和PACS2是與凋亡密切相關(guān)的重要因子，并很有可能參與了心衰過程中心肌結(jié)構(gòu)的重塑。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果都強(qiáng)有力地說明了miR-499可以通過調(diào)節(jié)PDCD4和PACS2的表達(dá)影響心肌細(xì)胞的凋亡。