升麻葛根湯抗炎鎮(zhèn)痛及體外抑菌作用的研究

秦汝蘭，王丹萍，呂重寧

升麻葛根湯為解表劑，源于《閻氏小兒方論》，又名平血飲，其藥材包括升麻6g，葛根9g，白芍6g，甘草6g［1-2］，該方具有辛涼解肌，透疹解毒之功.主治麻疹初起，疹發(fā)不出，身熱頭痛，咳嗽等癥狀［3-4］.方中君藥升麻的主要化學(xué)成分為苯丙素類(lèi)化合物.經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)［5-6］，苯丙素類(lèi)化合物以其顯著的抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛及抗氧化活性，逐漸成為研究的熱點(diǎn).方劑的臣藥—葛根，其主要化學(xué)成分葛根素及其衍生物具有較強(qiáng)的抗炎、抗痛風(fēng)作用［7-8］.本研究采用小鼠耳腫脹法、扭體法及熱板法三種模型，探討升麻葛根湯水提液的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，并通過(guò)K-B紙片擴(kuò)散法研究升麻葛根湯體外抑菌活性，為其藥理作用研究和臨床開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供一定的參考依據(jù).

1 材料、儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

升麻、葛根、白芍、甘草等藥材均購(gòu)于通化醫(yī)藥大廈，經(jīng)通化師范學(xué)院于俊林教授鑒定為升麻（Cimicifuga foetidaL.g）、葛根（Pueraria lobata（Willd.）Ohwig）、甘草（Glycyrrhiza.uralensisFischg）以及白芍（Paeonia lactiflorapallg）正品；阿司匹林腸溶片（石家莊康力藥業(yè)；批號(hào)：150203）；二甲苯（天津市恒興化學(xué)試劑；批號(hào)：20170325）；冰醋酸（天津富宇精細(xì)化工；批號(hào)：20161111）；MH瓊脂培養(yǎng)基（江門(mén)市凱琳貿(mào)易）；營(yíng)養(yǎng)肉湯（廣東環(huán)凱生物科技）；藥敏紙片（OXOID，廣州納特生物科技）；革蘭氏陽(yáng)性菌：金黃色葡萄球菌（Staphylo?coccus aureus）；革蘭氏陰性菌：大腸埃希菌（pseudomonas aeruginosa），兩種菌株來(lái)源于醫(yī)藥學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室.

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

KM小鼠，雄性，體重20±2g，由長(zhǎng)春高新醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心提供（動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（吉）2003-0004）.環(huán)境溫度23±2℃，相對(duì)濕度為50%～60%，飼養(yǎng)期間自由攝食飲水.

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

耳腫打耳器（直徑6mm，北京創(chuàng)博生物科技）；BS124S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)）；YLS-6B型熱板儀（濟(jì)南益延科技）；YXQLS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)醫(yī)療設(shè)備廠）；SPX生化培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)醫(yī)療設(shè)備廠）；凈化工作臺(tái)（上海新苗醫(yī)療器械）等.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 升麻葛根湯的制備

按照升麻葛根湯復(fù)方3倍用藥量，分別稱(chēng)取升麻6g、葛根9g、白芍6g、甘草6g，加入適量蒸餾水，浸泡過(guò)夜，回流提取2次，合并濾液，減壓濃縮，濃縮液定容至50mL，于-4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫R用前稀釋成所需濃度［9］.

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性KM小鼠，體重20±2g，隨機(jī)分成5組，分別為空白對(duì)照組（生理鹽水）、陽(yáng)性對(duì)照組（500mg·kg-1阿司匹林）、升麻葛根湯高（347.1mg·kg-1）、中（231.4mg·kg-1）、低（115.7mg·kg-1）劑量組，每組10只.經(jīng)口給藥14天，于末次給藥1h后，向各組小鼠右耳前后兩面分別均勻涂抹0.05mL二甲苯致炎，左耳涂以相同體積的蒸餾水作為對(duì)照，致炎30min后處死小鼠，沿耳廓基線(xiàn)將雙耳剪下，然后用直徑6mm的打孔器分別在左右耳相同的位置打下圓形耳片，立即稱(chēng)定，按公式計(jì)算小鼠耳部致炎后耳腫脹抑制率［10-11］.

耳腫脹抑制率（%）=（空白對(duì)照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度）/空白對(duì)照組腫脹度×100%

2.3 小鼠熱板法實(shí)驗(yàn)

將熱板儀溫度控制在55±0.5℃并將小鼠置于其上進(jìn)行觀察.小鼠第一次舔后足時(shí)間即為痛閾值，選取痛閾值在5～30s范圍內(nèi)的雄性KM小鼠50只，隨機(jī)分成5組，給藥方法同“2.2”項(xiàng)下方法.末次給藥前，測(cè)定每只小鼠痛閾值，實(shí)驗(yàn)共操作2次，每次實(shí)驗(yàn)操作間隔10min，計(jì)算小鼠給藥前平均痛閾值.分別測(cè)定各組小鼠于末次給藥后30min、60min、90min、120min時(shí)的痛閾值.若小鼠60s內(nèi)無(wú)反應(yīng)，應(yīng)立即取出小鼠，避免小鼠足部燙傷，其痛閾值按60s計(jì)［12-13］.

2.4 冰醋酸致小鼠扭體反應(yīng)模型鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)

選取雄性KM小鼠，體重20±2g，隨機(jī)分為5組，每組10只，分組及給藥同“2.2”項(xiàng)下方法.末次給藥前12h禁食，不禁水，末次給藥1h后，以0.1mL/10g體重的給藥量，腹腔注射0.6%冰醋酸溶液致炎，立即記錄各組小鼠15min內(nèi)扭體次數(shù)，根據(jù)公式計(jì)算抑制率［14-15］.

疼痛抑制率（%）=（空白對(duì)照組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù)）/空白對(duì)照組扭體次數(shù)×100%

2.5 K-B紙片擴(kuò)散法體外抑菌試驗(yàn)

（1）菌懸液及含菌平板的制備.取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌兩種試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌種，分別制成1011～1012cfu/L的均勻菌懸液.將融化后的滅菌培養(yǎng)基傾入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，待凝固后加入0.1mL菌懸液，用無(wú)菌涂布環(huán)涂布均勻，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，備用［16］.

（2）升麻葛根湯水提液抑菌作用及抑菌率考察.取直徑為6mm左右的藥敏紙片和陰性對(duì)照紙片均勻間隔貼于“2.5（1）”項(xiàng)下含菌平板表面，37℃恒溫培養(yǎng)18～24h后取出，用游標(biāo)卡尺測(cè)定各藥敏紙片抑菌圈直徑，平行操作3次，計(jì)算抑菌圈直徑的平均值.按下述標(biāo)準(zhǔn)判斷升麻葛根湯水提液抑菌作用：抑菌圈直徑d＝6mm為不敏感，6mm＜d＜10mm為低度敏感，10mm≤d＜15mm為中度敏感，15mm≤d＜20mm為高度敏感，d≥20mm為極敏感.敏感度越高表示抑菌效果越好［17］.

抑菌率（%）=（試驗(yàn)組抑菌圈平均直徑-空白濾紙片直徑）/空白濾紙片直徑×100%

（3）升麻葛根湯水提液最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定.采用二倍稀釋法將升麻葛根湯水提液配制成濃度為 400mg/mL、200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL、6.25mg/mL的稀釋液，用無(wú)菌鑷子將浸于不同濃度稀釋液后的藥敏紙片和陰性對(duì)照紙片均勻間隔貼于“2.5（1）”項(xiàng)下含菌平板表面，37℃下恒溫培養(yǎng)18～24h后取出，觀察菌體生長(zhǎng)情況，生長(zhǎng)菌體為陽(yáng)性（+），不生長(zhǎng)菌體為陰性（-），以不生長(zhǎng)菌體的最低稀釋濃度為升麻葛根湯水提液的最低抑菌濃度［18］.

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果與分析

3.1 升麻葛根湯對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)中，二甲苯可導(dǎo)致小鼠耳部血管擴(kuò)張、血管通透性增強(qiáng)，從而引起小鼠耳部腫脹.由表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，二甲苯致各組小鼠耳部腫脹效果顯著.與空白對(duì)照組比較，阿司匹林對(duì)照組對(duì)于小鼠的耳腫，具有較強(qiáng)的緩解作用（P＜0.01），抑制率為29.12%.升麻葛根湯高、中劑量組同樣表現(xiàn)出一定的抑制作用（P＜0.01；P＜0.05），抑制率分別為24.45%和18.93%，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可判斷，升麻葛根湯對(duì)二甲苯致小鼠耳廓急性炎性腫脹具有一定的抑制作用.

表1 二甲苯致耳腫脹模型抗炎實(shí)驗(yàn)（±s，n=10）

表1 二甲苯致耳腫脹模型抗炎實(shí)驗(yàn)（±s，n=10）

注：與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01.

組別空白對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組高劑量組中劑量組低劑量組抑制率(%)—29.12 24.45 18.93 10.87劑量（mg·kg-1）—500.0 347.1 231.4 115.7腫脹度（mg）11.78±1.47 8.35±0.93**8.90±1.75**9.55±0.95*10.50±0.84

3.2 升麻葛根湯對(duì)熱板法刺激疼痛的鎮(zhèn)痛作用

熱板法實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，三組給藥劑量組均使小鼠的痛閾值有所延長(zhǎng)，且呈劑量依賴(lài)性.給藥前空白對(duì)照組及各劑量組小鼠痛閾值無(wú)顯著性差異；與空白對(duì)照組比較，給藥后30min、60min、90min、120min后，升麻葛根湯高、中劑量組均能明顯延長(zhǎng)熱板所致小鼠的痛閾值（P＜0.05；P＜0.01）.給藥60min后，升麻葛根湯低劑量組也能夠明顯延長(zhǎng)熱板所致小鼠的痛閾值（P＜0.05），上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，升麻葛根湯各給藥劑量組小鼠對(duì)熱板刺激疼痛實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷拇碳っ舾?，?shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步提示升麻葛根湯具有鎮(zhèn)痛作用.

3.3 升麻葛根湯對(duì)冰醋酸致小鼠扭體的影響

由表3可知，與空白對(duì)照組相比，阿司匹林對(duì)照組和升麻葛根湯高劑量組均能夠明顯降低冰醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的次數(shù)（P＜0.01；P＜0.05），抑制率分別為37%和23%，提示升麻葛根湯對(duì)冰醋酸所致小鼠的疼痛性反應(yīng)具有對(duì)抗作用.

表2 升麻葛根湯對(duì)小鼠熱板疼痛反應(yīng)的影響（±s，n=10）

表2 升麻葛根湯對(duì)小鼠熱板疼痛反應(yīng)的影響（±s，n=10）

注：與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01.

組別空白對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組高劑量組中劑量組低劑量組120min 14.92±3.13 25.24±4.70**22.13±3.73*21.28±2.88*19.00±4.08劑量（mg·kg-1）—500.0 347.1 231.4 115.7給藥前15.87±2.48 18.28±2.42 17.43±3.03 17.78±1.21 17.41±2.25 30min 14.95±3.52 25.40±4.87**22.95±3.98*21.71±3.06*19.11±5.01 60min 16.57±2.18 25.27±4.01**24.32±2.65**21.71±2.91*21.10±2.84*90min 15.02±2.05 23.45±4.28**20.43±2.34*19.62±2.79*17.19±3.00

表3 冰醋酸致小鼠扭體反應(yīng)模型鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)（±s，n=10）

表3 冰醋酸致小鼠扭體反應(yīng)模型鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)（±s，n=10）

注：與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01.

組別空白對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組高劑量組中劑量組低劑量組扭體次數(shù)25.00±4.08 15.75±4.35**19.25±3.20*20.75±2.06 22.25±2.22劑量（mg·kg-1）—500.0 347.1 231.4 115.7抑制率（%）—37 23 17 11

3.4 升麻葛根湯對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用

由表4可得出，升麻葛根湯對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有不同程度的抑制作用，抑菌率分別為87.17%、57.17%，且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果優(yōu)于大腸桿菌.

表4 升麻葛根湯水提液抑菌作用及抑菌率（±s，n=3）

表4 升麻葛根湯水提液抑菌作用及抑菌率（±s，n=3）

試驗(yàn)菌種金黃色葡萄球菌大腸桿菌抑菌圈平均直徑（mm）11.23±0.25 9.43±0.40抑菌率(%)87.17 57.17

3.5 升麻葛根湯對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌最小抑菌濃度的影響

通過(guò)表5可以看出，升麻葛根湯水提液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果更明顯，當(dāng)升麻葛根湯濃度低于12.5mg·mL-1時(shí)，金黃色葡萄球菌出現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)；當(dāng)升麻葛根湯濃度低于50mg·mL-1濃度時(shí)，大腸桿菌顯示出明顯的生長(zhǎng).由此得出，升麻葛根湯對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度分別為12.5mg·mL-1、50mg·mL-1.

表5 升麻葛根湯水提液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度（MIC）

4 討論

二甲苯所致小鼠耳腫脹的急性炎癥反應(yīng)，可能涉及炎癥介質(zhì)的釋放，如5-羥色胺或緩激肽等.本研究選用二甲苯致炎模型研究升麻葛根湯的抗炎作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，升麻葛根湯高劑量組能顯著減輕小鼠耳腫脹程度，抑制率為24.45%，分析其原因可能為升麻葛根湯能夠抑制5-羥色胺或緩激肽等炎癥介質(zhì)的釋放，從而使小鼠耳腫脹程度有所緩解.小鼠熱板法實(shí)驗(yàn)的原理是通過(guò)一定強(qiáng)度的溫度來(lái)刺激小鼠足部產(chǎn)生疼痛反應(yīng)，并以熱刺激開(kāi)始至舔足部的反應(yīng)時(shí)間為依據(jù)評(píng)價(jià)藥物的鎮(zhèn)痛作用，是一種反射性測(cè)痛模型［19］.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)熱板法研究升麻葛根湯的鎮(zhèn)痛作用，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，升麻葛根湯高、中、低劑量組在不同測(cè)試時(shí)間點(diǎn)能明顯延長(zhǎng)小鼠舔后足的時(shí)間，表明升麻葛根湯具有一定的鎮(zhèn)痛作用.曹麗等［20］對(duì)升麻不同品種炮制前后的抗炎鎮(zhèn)痛藥理作用研究發(fā)現(xiàn)，升麻各樣品對(duì)小鼠熱刺激的痛閾值均有所增加.本研究還采用了另外一種經(jīng)典致痛模型即冰醋酸致小鼠扭體反應(yīng)，該反應(yīng)是通過(guò)醋酸刺激腹膜引起炎性疼痛來(lái)觀察小鼠表現(xiàn)的扭體反應(yīng)，此實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑楹Y選非甾體抗炎鎮(zhèn)痛作用的一種敏感實(shí)驗(yàn)方法［21］.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，升麻葛根湯高濃度劑量組能顯著減少醋酸所致小鼠的扭體反應(yīng)次數(shù)，抑制率為23%.以上各實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，升麻葛根湯具有良好的抗炎鎮(zhèn)痛效果.

紙片擴(kuò)散法常用于考察藥物的抑菌活性，具有簡(jiǎn)單、易操作等優(yōu)點(diǎn).紙片擴(kuò)散法實(shí)驗(yàn)中，藥物在擴(kuò)散的同時(shí)紙片周?chē)志鷿舛确秶鷥?nèi)的測(cè)試菌不能生長(zhǎng)，而抑菌濃度范圍外的菌株則繼續(xù)生長(zhǎng)，通過(guò)紙片周?chē)纬傻耐该饕志Φ闹睆酱笮》从硿y(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度，且抑菌圈直徑的大小與該藥對(duì)測(cè)試菌的最低抑菌濃度（MIC）呈負(fù)相關(guān)，即抑菌圈越大，MIC越小，藥物的抑菌作用越強(qiáng)［22］.在體外抑菌實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)升麻葛根湯水提液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有較好的體外抑菌作用，且對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果優(yōu)于大腸桿菌，抑菌率分別為87.17%、57.17%.最低抑菌濃度實(shí)驗(yàn)與抑菌作用實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致，升麻葛根湯水提液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的體外抑菌最低濃度分別為12.5mg·mL-1、50mg·mL-1.

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用小鼠耳腫脹法、扭體法及熱板法三種抗炎鎮(zhèn)痛模型以及K-B紙片擴(kuò)散法，研究升麻葛根湯水提液的抗炎、鎮(zhèn)痛作用和抑菌活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，升麻葛根湯具有良好的抗炎鎮(zhèn)痛作用及體外抑菌活性，其抗炎作用機(jī)制可能與升麻葛根湯抑制5-羥色胺或緩激肽等炎癥介質(zhì)的釋放有關(guān)，但具體作用機(jī)制有待后續(xù)更深入地研究，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為升麻葛根湯制劑的臨床開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供一定的參考依據(jù).