結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)在結(jié)核性漿膜炎中的診斷價(jià)值研究*

傅滿姣，吳佳玲，貝承麗，翟安，楊芬，王慧，曹士鵬，葉江英

（湖南省長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

結(jié)核性漿膜炎是最常見(jiàn)的肺外結(jié)核，目前結(jié)核性漿膜炎診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是結(jié)核桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性、組織病理活檢證實(shí)為結(jié)核干酪樣壞死[1-2]。但結(jié)核桿菌培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)且陽(yáng)性率低，而活檢是有創(chuàng)檢查，部分患者無(wú)法耐受。而結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)（tuberculin skin test,TST）、漿膜腔積液常規(guī)生化、結(jié)核桿菌脫氧核糖核酸（tuberculosis deoxyribonucleic acid, TB-DNA）檢測(cè)等常規(guī)臨床檢測(cè)方法又存在敏感性和特異性低的問(wèn)題，因此急需一項(xiàng)簡(jiǎn)便耗時(shí)短、敏感性及特異性均高的結(jié)核性漿膜炎診斷方法。近年來(lái)，外周血γ－干擾素釋放試驗(yàn)（interferon-gamma release assays, IGRAs）已成為診斷結(jié)核感染的常用方法，其診斷結(jié)核的特異性明顯高于TST[3]。有研究顯示，來(lái)自結(jié)核感染部位的體液樣本，其中單核細(xì)胞數(shù)量高于外周血單核細(xì)胞數(shù)量[4-5]。因此筆者推測(cè)漿膜腔積液結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（tuberculosis infection T cell spot test,T-SPOT.TB）檢測(cè)可以大大提高結(jié)核性漿膜炎的早期診斷率。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年8月-2016年3月湖南省長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院住院收治的結(jié)核性漿膜腔積液患者102例作為結(jié)核組。其中，男性69例，女性33例；年齡18～75歲；結(jié)核性胸膜炎54例，結(jié)核性腹膜炎28例，結(jié)核性心包炎20例；92例有發(fā)熱；患者結(jié)核確診41例，臨床診斷61例；經(jīng)抗結(jié)核治療96例明顯好轉(zhuǎn)，4例放棄治療，1例合并重癥肺炎并放棄治療，2例合并腎衰，2例結(jié)核性心包炎，另有1例合并全身多器官結(jié)核死亡。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者病史采集、體格檢查、胸部影像學(xué)檢查（胸部CT、X射線）、TST、漿膜腔積液常規(guī)檢查、漿膜腔積液生化檢查、T-SPOT.TB、TBDNA、患者痰和漿膜腔積液抗酸涂片染色及結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)等資料齊全。②漿膜腔積液結(jié)核分枝桿菌抗酸染色涂片培養(yǎng)陽(yáng)性，或有典型的組織病理學(xué)改變（干酪樣壞死、上皮樣肉芽腫改變等），且有臨床癥狀、體格檢查及影像學(xué)表現(xiàn)支持，定義為結(jié)核確診患者；患者臨床表現(xiàn)、體格檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查（漿膜腔積液常規(guī)、生化）及胸部影像學(xué)表現(xiàn)符合結(jié)核性漿膜炎，且診斷性抗結(jié)核治療有效，定義為結(jié)核臨床診斷患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有HIV感染、嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良、惡病質(zhì)、麻疹及水痘。選取同期本院收治的非結(jié)核性漿膜腔積液患者50例作為非結(jié)核組。其中，男性35例，女性15例；年齡28～78歲；腫瘤轉(zhuǎn)移至胸膜25例，膿胸5例，自發(fā)性腹膜炎3例，腫瘤轉(zhuǎn)移至腹膜11例，心力衰竭致心包積液2例，腫瘤轉(zhuǎn)移至心包4例，腫瘤患者逐漸惡化，心力衰竭患者好轉(zhuǎn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者病史采集、體格檢查、胸部影像學(xué)檢查（胸部CT、X射線）、TST、漿膜腔積液常規(guī)檢查、胸膜腔積液生化檢查、T-SPOT.TB、TB-DNA、患者痰和漿膜腔積液抗酸涂片染色及結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)等資料齊全；②痰、漿膜腔積液涂片抗酸染色、結(jié)核培養(yǎng)或組織病理學(xué)結(jié)果為陰性，無(wú)結(jié)核接觸史及陳舊性結(jié)核病史，并可以明確診斷為其他疾病，針對(duì)原發(fā)疾病治療有效果[4]。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有HIV感染、嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良、惡病質(zhì)、麻疹及水痘。兩組患者的年齡、性別、激素及免疫抑制劑使用、既往結(jié)核病史及基礎(chǔ)疾病比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

患者入院后取新鮮漿膜腔積液約50 ml，在漿膜腔積液標(biāo)本采集后2 h內(nèi)送本院檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，在4h內(nèi)完成T-SPOT.TB、腺苷脫氨酶（adenosine deaminase,ADA）、TB-DNA及結(jié)核桿菌培養(yǎng)檢測(cè)。

1.2.1 T-SPOT.TB 本研究采用T-SPOT.TB試劑盒（英國(guó)Oxford Immunotec公司）。將漿膜腔積液患者的標(biāo)本分離得到單個(gè)核細(xì)胞，并馬上制備成細(xì)胞濃度為2.5×106/ml的細(xì)胞懸液。將相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照，取植物血凝素作為相應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照，采用結(jié)核桿菌特異性抗原-早期分泌抗原靶蛋白（6kD early secreting antigenictarget-6, ESAT-6）和培養(yǎng)濾液蛋白10（culture filtrateprotein10KD, CFP-10）作為刺激抗原。在檢測(cè)板的每個(gè)孔內(nèi)加入抗原和單個(gè)核細(xì)胞，將微孔板放在含5%二氧化碳CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h；48 h后洗板，并加入生物素標(biāo)記的相應(yīng)二抗，放置于2～8℃的環(huán)境中反應(yīng)1 h，再次洗板并加入顯色底物液，在室溫下靜置約7 min后用去離子水終止顯色反應(yīng)。上機(jī)檢測(cè)斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)。ESAT-6和CFP-10的斑點(diǎn)數(shù)任一項(xiàng)＞50SFCs/106SEMC定義為陽(yáng)性。

1.2.2 漿膜腔積液上清ADA的檢測(cè) 采用加入EDTA抗凝劑的玻璃瓶收集漿膜腔積液10 ml，3 000 r/min離心5 min，取漿膜腔積液上清，并用用酶比法（寧波美康生物科技有限公司提供試劑盒）檢測(cè)上清液中ADA的相應(yīng)含量，ADA＞45 u/L定義為陽(yáng)性。

1.2.3 TB-DNA檢測(cè) 采用結(jié)核桿菌特異性引物、特異性熒光探針，混合PCR的反應(yīng)液、Tap酶、核苷酸單體，采用PCR體外擴(kuò)增法（廣州市中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司提供試劑盒）檢測(cè)結(jié)核桿菌DNA。

1.2.4 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)檢測(cè) 采用液體培養(yǎng)基及BACTEC-TB 960法進(jìn)行漿膜腔積液的分枝桿菌快速培養(yǎng)，取5 ml漿膜腔積液于無(wú)菌試管中送檢，根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；繪制ROC曲線，計(jì)算敏感性、特異性、Youden指數(shù)、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 漿膜腔積液T-SPOT.TB患者診斷結(jié)核性漿膜腔炎的ROC曲線

將152例漿膜腔積液T-SPOT.TB患者檢測(cè)結(jié)果繪制成ROC曲線，曲線下面積為0.893（95%CI：0.834，0.952），漿膜腔積液中T-SPOT.TB的最佳診斷閾值（cutoff值）為斑點(diǎn)數(shù)108.5SFCs/106SEMC（Youden指數(shù)最高）。見(jiàn)圖1。

2.2 不同漿膜腔炎中T-SPOT.TB的敏感性比較

圖1 漿膜腔積液T-SPOT.TB診斷結(jié)核性漿膜腔炎的ROC曲線

T-SPOT.TB診斷結(jié)核性胸膜炎、結(jié)核性腹膜炎及結(jié)核性心包炎的敏感性分別為92.6%、89.3%和80.0%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.688，P=0.268）。

2.3 各檢測(cè)指標(biāo)敏感性、特異性、Youden指數(shù)、陽(yáng)性及陰性預(yù)測(cè)值比較

T-SPOT.TB分別與ADA、TB-DNA、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的敏感性和特異性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.867、6.069和 3.911，P=0.027、0.014和 0.048）。T-SPOT.TB的Youden指數(shù)高于ADA、TB-DNA及結(jié)核分枝桿菌。T-SPOT.TB的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值高于ADA及TB-DNA，僅低于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)。T-SPOT.TB的陰性預(yù)測(cè)值高于ADA、TB-DNA及結(jié)核分枝桿菌。見(jiàn)附表和圖1～4。

附表 各檢測(cè)指標(biāo)敏感性、特異性、Youden指數(shù)、陽(yáng)性及陰性預(yù)測(cè)值比較

圖3 漿膜腔積液TB-DNA診斷結(jié)核性漿膜腔炎的ROC曲線

圖4 漿膜腔積液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)診斷結(jié)核性漿膜腔炎的ROC曲線

3 討論

漿膜腔積液在臨床實(shí)際工作中多見(jiàn)，病因有：結(jié)核、惡性腫瘤原發(fā)和轉(zhuǎn)移、非結(jié)核感染、肝硬化、腎病及心功能不全等，結(jié)核性漿膜腔積液在我國(guó)較多見(jiàn)。結(jié)核性漿膜腔積液早期臨床癥狀不典型，難以根據(jù)臨床表現(xiàn)、積液的常規(guī)生化早期診斷。T-SPOT.TB檢測(cè)中納入結(jié)核分枝桿菌特異抗原，即ESAT-6和CFP-10，由RD1區(qū)編碼[5-7]。該區(qū)只存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和少數(shù)致病性非結(jié)核分枝桿菌基因組中，用ESAT-6和CFP-10作為結(jié)核分枝桿菌感染的特異性T細(xì)胞刺激抗原，通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測(cè)受試者體內(nèi)是否存在結(jié)核效應(yīng)T細(xì)胞，從而判斷受試者是否感染結(jié)核分枝桿菌。本研究中，行漿膜腔積液T-SPOT.TB檢測(cè)可以獲得較高的敏感性、特異性、Youden指數(shù)、陽(yáng)性及陰性預(yù)測(cè)值。且本研究所獲得的T-SPOT.TB敏感性值與之前報(bào)道大體一致[8-12]。本研究中，結(jié)核性胸膜炎的敏感性為92.6%，結(jié)核性腹膜炎的敏感性為89.3%，結(jié)核性心包炎的敏感性為80.0%，T-SPOT.TB診斷結(jié)核性胸膜炎敏感性高，可能與結(jié)核性胸膜炎較其它漿膜炎多見(jiàn)有關(guān)。3者的TSPOT.TB敏感性均＞80%，提示漿膜腔的TSPOT.TB檢測(cè)對(duì)診斷結(jié)核性胸膜炎、腹膜炎及心包炎均有一定臨床價(jià)值。

本研究得出漿膜腔積液T-SPOT.TB的敏感性88.2%和特異性86.0%，與張麗帆等[6]報(bào)道的漿膜腔積液T-SPOT.TB的靈敏度性91.9%和特異性87.1%相似。本研究中漿膜腔積液的ADA敏感性低于T-SPOT.TB，敏感性僅為45.2%，說(shuō)明ADA與T-SPOT.TB相比，難以檢測(cè)到結(jié)核性胸膜炎的發(fā)生。漿膜腔積液TB-DNA的敏感性在本研究中僅為9.8%，與萬(wàn)榮等[13]觀察的150例結(jié)核性胸膜炎中的TB-DNA診斷敏感性7.4%相似。但TRAJMAN等[14]研究發(fā)現(xiàn)：TB-DNA診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感性為35%～82%，特異性為85.4%～100%，高于本研究敏感性數(shù)值，考慮與選擇患者病情嚴(yán)重程度、肺結(jié)核是否接近胸膜有關(guān)。TB-DNA特異性在本研究中為98%，與TRAJMAN等[14]的研究結(jié)果相近。本研究中結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)敏感性為18.6%，特異性為100%，與陳希等[15]所報(bào)道的93例胸腔積液的結(jié)核培養(yǎng)靈敏度性（14.6%）和特異度（100%）相似。這充分說(shuō)明，漿膜腔積液的結(jié)核培養(yǎng)作為結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，具有相當(dāng)高的特異性，但是結(jié)核培養(yǎng)周期長(zhǎng)、假陰性率高，嚴(yán)重地制約了結(jié)核桿菌培養(yǎng)在臨床上的應(yīng)用。

本研究中T-SPOT.TB的陰性預(yù)測(cè)值高于其他預(yù)測(cè)指標(biāo)，提示T-SPOT.TB診斷結(jié)核性漿膜積液的假陰性率低，T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果陰性表示罹患結(jié)核的可能性非常小，對(duì)于排除結(jié)核性漿膜炎更有臨床診斷價(jià)值。本研究中T-SPOT.TB檢測(cè)出現(xiàn)7例假陽(yáng)性，其中肺癌轉(zhuǎn)移患者5例，卵巢癌轉(zhuǎn)移患者1例，乳腺癌轉(zhuǎn)移患者1例，這可能與腫瘤患者免疫力低下，取漿膜腔積液樣本時(shí)正處于結(jié)核潛伏感染期或者為陳舊性肺結(jié)核患者。在臨床實(shí)際工作中，曾出現(xiàn)痰涂片陽(yáng)性，但T-SPOT.TB檢測(cè)陰性的情況，這也可能與目前結(jié)核輔助篩查手段胸部CT難以發(fā)現(xiàn)微小的胸部結(jié)核病灶相關(guān)[16]。因此T-SPOT.TB檢測(cè)陽(yáng)性，必須要結(jié)合結(jié)核相關(guān)臨床表現(xiàn)及相關(guān)輔助檢查綜合判斷，指導(dǎo)患者的診療。本研究也出現(xiàn)假陰性的情況，原因可能與在采漿膜腔積液樣本時(shí)，雖有結(jié)核桿菌感染，但體內(nèi)的T細(xì)胞未致敏，或者當(dāng)患者合并HIV等免疫缺陷疾病時(shí)，機(jī)體難以對(duì)結(jié)核桿菌產(chǎn)生應(yīng)有的免疫應(yīng)答，因此當(dāng)T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果陰性時(shí)，也不能單憑這一結(jié)果否定結(jié)核的診斷，而應(yīng)當(dāng)考慮患者的臨床表現(xiàn)、其他輔助檢查結(jié)果，綜合評(píng)判。NEMETH等[17]認(rèn)為，結(jié)核桿菌感染的部位具有隔室化的特點(diǎn)，即機(jī)體免疫系統(tǒng)中大量T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞被募集到結(jié)核感染部位，并且分泌大量的細(xì)胞因子從而發(fā)揮對(duì)結(jié)核桿菌的免疫應(yīng)答。本研究中漿膜腔積液T-SPOT.TB檢測(cè)陽(yáng)性率較高，T細(xì)胞敏感性高，也支持該結(jié)論。隨著醫(yī)學(xué)生物技術(shù)的發(fā)展，T-SPOT.TB檢測(cè)技術(shù)樣本已經(jīng)不再局限于外周血標(biāo)本，胸水、腹水、纖維支氣管鏡下支氣管肺泡灌洗液、痰液及心包穿刺液等已嘗試用于結(jié)核檢測(cè)。

目前，有研究者嘗試用結(jié)核性腦脊液進(jìn)行T-SPOT.TB檢測(cè)，但是因腦脊液中T細(xì)胞數(shù)太少，難以檢測(cè)。目前胸水用于T-SPOT.TB檢測(cè)的研究較為深入，本研究發(fā)現(xiàn)T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)核性胸腔積液具有較高的敏感性和特異性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)除了用于檢測(cè)結(jié)核性胸膜炎，T-SPOT.TB檢測(cè)用于結(jié)核性腹膜炎、心包炎同樣具有較高的敏感性、特異性、陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)值，對(duì)早期診斷結(jié)核性胸腔積液有較高的臨床診斷價(jià)值。