調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在不同分期卵巢癌患者中的臨床意義

戴 然 桑秀麗

卵巢癌致死率占婦科惡性腫瘤的首位，嚴(yán)重威脅女性生命健康。隨著免疫學(xué)的迅速發(fā)展，關(guān)于卵巢癌細(xì)胞免疫的研究，引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注。有研究表明，卵巢癌的發(fā)生以及發(fā)展，除了與癌細(xì)胞的侵襲和惡性增殖有關(guān)外，與患者自身免疫調(diào)節(jié)功能的失衡也密切相關(guān)[1]，而淋巴細(xì)胞亞群的變化在這一過(guò)程中起重要作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是一類(lèi)T細(xì)胞亞群，具有阻止自身炎癥疾病以及免疫病發(fā)生、調(diào)控免疫應(yīng)答等作用，是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[2-4]。Tregs主要指CD4+CD25+Treg[5]。大量研究顯示，多數(shù)腫瘤患者中，Treg表達(dá)水平會(huì)異常升高，患者抗腫瘤免疫功能低下，而下調(diào)CD4+CD25+Treg活性或清除，其抗腫瘤活性可顯著的增加，表明CD4+CD25+Treg的高表達(dá)抑制了患者自身抗腫瘤作用[6-8]。本研究檢測(cè)卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+Treg水平，研究其與疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取我院2012年1月至2016年12月收治的卵巢癌患者58例，年齡21～72歲，平均(55.2±12.1)歲；根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)(FIGO)分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期6例，Ⅲ期31例，Ⅳ期16例；病理類(lèi)型：黏液性癌11例，漿液性癌32例，卵巢交界性囊腺癌、腺瘤和混合癌總共15例。選取卵巢良性患者30例，年齡25～72歲，平均(53.1±10.2)歲；無(wú)免疫性疾病的健康女性35例，年齡22～71歲，平均(51.2±11.3)歲。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器 Calibur流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)Becton Dickinson)；ZD-85恒溫振蕩器(中國(guó)常熟國(guó)華企業(yè))；KDC-1042低速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)；加樣器(量程分別為20 μl，50 μl，100 μl等)(法國(guó)GILSON)；TECAN酶標(biāo)儀(奧地利)。

1.2.2 主要試劑 鼠抗人抗體：FITC-anti-CD4，PE-anti-CD8，PE-anti-CD25， 同型對(duì)照抗體均購(gòu)自美國(guó)BD公司。紅細(xì)胞裂解液。腫瘤相關(guān)抗原CA125酶免試劑(瑞典CanAg診斷試劑公司)。

1.2.3 收集標(biāo)本 要求所有卵巢癌患者及健康者清晨空腹，采集其靜脈血3 ml，立即以EDTA-K2抗凝，兩者混勻。將單據(jù)號(hào)等患者信息貼在試管外壁上。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)步驟 于每試管中加入100 μl的抗凝血，之后各加入相應(yīng)抗體10 μl，振蕩使之充分混勻，室溫避光孵育20 min，加入500 μl的裂解液，裂解紅細(xì)胞，振蕩使之充分混勻，暗處孵育10 min。洗滌，1 200 r/min，離心5 min，棄去上清液；加入1 ml PBS，1 200 r/min，離心5 min，棄去上清液。加入300 μl PBS混勻，待流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 觀(guān)察指標(biāo)

應(yīng)用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)CD4+CD25+Treg在CD4+T細(xì)胞中所占百分比，CD4+CD25+Treg占全體T細(xì)胞百分比，CD4+在CD8+T細(xì)胞中所占百分比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 健康女性、卵巢良性患者、卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+Treg/CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+比值對(duì)比

卵巢癌患者CD4+CD25+Treg/CD4+T 細(xì)胞的比值明顯高于健康女性和卵巢良性患者，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，卵巢良性患者外周血中CD4+CD25+Treg/CD4+T 細(xì)胞的比值與健康女性相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。健康女性、卵巢良性患者與卵巢癌患者外周血中CD4+/CD8+相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。見(jiàn)表1。

2.2 檢測(cè)FIGO分期里CD4+CD25+Treg/全體T細(xì)胞比值

卵巢癌患者外周血里CD4+CD25+Treg/全體T細(xì)胞分別為Ⅰ～Ⅱ期(17.96±4.32)、Ⅲ期(20.02±6.21)、Ⅳ期(28.73±4.21)，與國(guó)際FIGO分期呈正相關(guān)關(guān)系，分期越晚，CD4+CD25+Treg與全體T細(xì)胞的比值越高； Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ期相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ期患者與Ⅳ期相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 健康女性、卵巢良性患者、卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+Treg/CD4+，CD4+/CD8+的比較

*為與健康女性組比，P<0.05;#為與卵巢良性患者組比，P<0.05。

3 討論

Sakaguchi等在1995年發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)，其對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)有著重要調(diào)控功能[9]。在生理和病理狀態(tài)下，CD4+CD25+Treg對(duì)調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答、維持機(jī)體免疫自穩(wěn)等起著重要作用[10]。尤其在病理狀態(tài)下，許多腫瘤抗原為自身抗原，CD4+CD25+Treg增加，在維持對(duì)自身成分耐受的同時(shí)，阻止了機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸，促進(jìn)了腫瘤生長(zhǎng)[11-13]。1999 年，Onizuka通過(guò)實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，CD4+CD25+Treg抑制了針對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答[14]。Wolf等發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤患者腫瘤局部和外周血里，CD4+CD25+Treg的比例升高，數(shù)量同患者預(yù)后及腫瘤進(jìn)展程度相關(guān)[15]。

通過(guò)流式細(xì)胞分析儀，本研究檢測(cè)了健康女性、卵巢良性患者、卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+Treg的分布情況，結(jié)果表明，卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+Treg/CD4+T細(xì)胞的比例明顯高于卵巢良性患者及健康女性，表明卵巢癌患者外周血中Treg的功能增強(qiáng)。卵巢癌患者外周血中CD4+/CD8+T細(xì)胞比例與健康女性，卵巢良性患者相比，P>0.05，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此推測(cè)，CD4+CD25+Treg誘導(dǎo)的腫瘤免疫逃逸，主要在病灶局部的微環(huán)境中發(fā)生。同時(shí)，卵巢癌患者外周血中CD4+/CD8+T細(xì)胞比例低于健康女性，卵巢良性患者，表明Treg抑制CD4+等淋巴細(xì)胞的增殖、活化，限制了機(jī)體抗腫瘤免疫功能。在國(guó)際FIGO分期中，Ⅳ期卵巢癌患者外周血里CD4+CD25+Treg比例明顯高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期。晚期卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+Treg數(shù)量會(huì)增加，出現(xiàn)這種現(xiàn)象，可能是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原刺激產(chǎn)生的生理性增殖或腫瘤誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖。其發(fā)生的機(jī)制可能是：腫瘤細(xì)胞較少，其免疫源性足以刺激免疫應(yīng)答，機(jī)體免疫監(jiān)視功能可以有效地清除腫瘤細(xì)胞，相應(yīng)CD4+CD25+Treg存在，腫瘤免疫應(yīng)答維持在一個(gè)適度水平；當(dāng)腫瘤細(xì)胞免疫源性接近正常組織或較弱，CD4+CD25+Treg發(fā)揮類(lèi)似于維持自身耐受作用，保護(hù)腫瘤細(xì)胞。

綜上所述， CD4+CD25+Treg細(xì)胞格局的改變對(duì)卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展以及分期，起著重要作用，是卵巢癌療效監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)。CD4+CD25+Treg比例升高，增殖時(shí)，會(huì)抑制機(jī)體產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致腫瘤的免疫逃逸，促使腫瘤進(jìn)行性生長(zhǎng)。在卵巢癌患者的治療中，恰當(dāng)?shù)厍宄蛘呦抡{(diào)CD4+CD25+Treg，使之維持活化效應(yīng)T細(xì)胞，有利于提高患者機(jī)體抗腫瘤免疫，抑制腫瘤生長(zhǎng)，減輕腫瘤負(fù)荷。