Y-box結(jié)合蛋白-1與增殖細(xì)胞核抗原在胃癌組織的表達(dá)及與其臨床病理特征的相關(guān)性

孫 曉

胃癌是1種惡性程度較高的消化系統(tǒng)腫瘤疾病，病情進展迅速，死亡率目前居我國首位，嚴(yán)重威脅患者生命安全[1]。胃癌早期發(fā)病隱匿，確診難度較大，就診時多數(shù)患者已進展至中晚期或發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，胃癌分子生物學(xué)診斷、預(yù)后評價相關(guān)特異性標(biāo)志物取得了較大的研究進展，對疾病的早期診斷、手術(shù)治療效果及術(shù)后放化療評價等提供了一定的依據(jù)。Y-box結(jié)合蛋白-1(YB-1)與增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是與腫瘤細(xì)胞惡性增殖相關(guān)的標(biāo)志物，在多種腫瘤疾病中均有高表達(dá)現(xiàn)象[2-3]，本研究即探討YB-1、PCNA在胃癌組織中的表達(dá)情況及其與臨床病理特征的相關(guān)性，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2015年10月～2017年2月本院收治的原發(fā)性胃癌患者116例，所有患者均經(jīng)影像學(xué)及術(shù)后病理組織檢查確診，于我院擇期行根治術(shù)治療，且術(shù)前均未接受放化療及內(nèi)分泌等抗腫瘤藥物治療。116例患者中男性73例，女性43例；平均年齡(58.52±7.14)歲；平均病程(5.32±3.73)年；按AJCC胃癌分期手冊(2010年)進行TNM分期：Ⅰ期36例，Ⅱ期42例，Ⅲ期28例；Ⅳ期10例；分化程度：低分化35例，中分化48例，高分化33例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有49例，無67例。將116例患者術(shù)中切除的胃癌組織作為實驗組樣本，另選取其中20例患者距腫瘤組織5 cm處的癌旁組織作為對照組。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑和儀器 鼠抗人YB-1單克隆抗體(Santa Cruz公司)，鼠抗人PCNA單克隆抗體(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，免疫組化SP試劑盒、DAB顯色試劑盒、HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗(北京中山生物技術(shù)有限公司)。石蠟切片機(Leica公司)，光學(xué)顯微鏡(Olympus Optical公司)。

1.2.2 檢測方法 將術(shù)中切除的胃癌組織標(biāo)本及癌旁組織標(biāo)本經(jīng)生理鹽水沖洗后用液氮進行迅速冷凍后超低溫冰箱保存。采用SP法測定組織中YB-1和PCNA陽性表達(dá)情況：將切除組織經(jīng)中性甲醛固定后進行石蠟包埋，制作厚約4 μm石蠟切片，載玻片經(jīng)多聚賴氨酸包被后進行貼片，恒溫烤箱70 ℃干燥80 min；二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，檸檬酸緩沖液修復(fù)抗原后3% H2O2封閉10 min，PBS洗滌3次；分別滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗：鼠抗人YB-1單克隆抗體、鼠抗人PCNA單克隆抗體并于4 ℃冰箱孵育過夜；棄一抗，PBS洗滌3次，滴加HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗，于37 ℃恒溫箱放置20 min；加DAB工作液避光顯色3～5 min，蘇木精復(fù)染5 min，脫水至透明，中性樹膠封片。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)

采用半定量計數(shù)法進行結(jié)果判定，由2名高年資病理醫(yī)師采用雙盲法于高倍鏡下選10個視野，計算出陽性細(xì)胞數(shù)百分比：①陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例：≤10%為0分；11%～25%為1分；26%～50%為2分；≥50%為3分。②染色強度評分標(biāo)準(zhǔn)：不著色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；黃褐色為3分。上述兩項的積作為該切片的最后評分，<3分為陰性表達(dá)(-)，≥3分為陽性表達(dá)(+)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 2組中YB-1和PCNA表達(dá)比較

YB-1在胃癌組織中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中，PCNA主要表達(dá)于細(xì)胞核中，高陽性表達(dá)均呈黃色或棕黃色顆粒，且顯色清晰。實驗組YB-1表達(dá)陽性81例(69.83%)，PCNA表達(dá)陽性72例(62.07%)，另外對照組中YB-1表達(dá)陽性4例(20.00%)，PCNA表達(dá)陽性3例(15.00%)。實驗組胃癌組織中YB-1、PCNA的陽性表達(dá)率顯著高于對照組癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 2組YB-1和PCNA表達(dá)水平比較(例，%)

2.2 YB-1和PCNA陽性表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

在胃癌組織中YB-1和PCNA陽性表達(dá)與患者的年齡、性別無關(guān)(P>0.05)，與AJCC分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度有相關(guān)性(P<0.01)，見表2。

2.3 胃癌組織中YB-1和PCNA表達(dá)的相關(guān)性分析

胃癌組織中，YB-1和PCNA表達(dá)均為陽性68例，均為陰性31例。YB-1表達(dá)與PCNA表達(dá)呈正相關(guān)性(γ=0.478)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

3 討論

胃癌發(fā)病機制復(fù)雜，是1個多因素、漫長的過程；癌癥的分子生物學(xué)基礎(chǔ)通常表現(xiàn)為癌基因的激活及抑癌基因的失活等，近年來，越來越多的研究表明血管新生、癌細(xì)胞增殖及侵襲與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

研究表明[4]，惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中細(xì)胞增殖調(diào)控發(fā)揮著重要作用。YB-1為DNA/RNA結(jié)合蛋白，普遍存在于各種生物細(xì)胞中，通過與目的基因序列內(nèi)部的Y-box特異性結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，同時具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和生長，并參與RNA剪切及DNA修復(fù)等生物學(xué)過程。Didier等[5]最早發(fā)現(xiàn)，YB-1可通過與人類MHC ClassⅡ基因啟動子區(qū)內(nèi)Y-box序列特異性結(jié)合，進而抑制MHC ClassⅡ的轉(zhuǎn)錄活性，為負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子。Jurchott等[6]研究表明，YB-1能控制細(xì)胞生長周期，引起細(xì)胞的過度增殖，可能與其能特異性與細(xì)胞周期蛋白A、B1的啟動子結(jié)合，促進其蛋白水平增加有關(guān)。目前在非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤研究中均發(fā)現(xiàn)且證實YB-1存在核移位現(xiàn)象，同時表達(dá)量也較正常細(xì)胞明顯偏高。另外研究還表明[7]，YB-1可以通過與基質(zhì)金屬蛋白酶2基因特異性相結(jié)合，激活基因轉(zhuǎn)錄，促進惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。PCNA在細(xì)胞核內(nèi)合成的1種酸性蛋白，分子量約為36 kD，為DNA聚合酶的輔助蛋白，調(diào)節(jié)DNA的復(fù)制。在細(xì)胞各周期中可溶性PCNA的表達(dá)量相對穩(wěn)定，而不溶性的PCNA的表達(dá)量在細(xì)胞周期S期達(dá)到峰值，G0～G1期無明顯表達(dá)，因此其可作為惡性腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)的1個指標(biāo)。同時研究表明，細(xì)胞增殖活性的增高可使腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶進而實現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。張文娟等[8]研究發(fā)現(xiàn)，PCNA高表達(dá)是非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的1個重要指標(biāo)。魏麗[9]研究結(jié)果顯示，PCNA在甲狀腺腫瘤組織中的表達(dá)量明顯高于對癌旁正常組織，同時PCNA在5年內(nèi)死亡患者的表達(dá)率明顯高于存活組。本研究結(jié)果顯示，YB-1在胃癌組織中主要表達(dá)于細(xì)胞漿或細(xì)胞膜中，PCNA主要表達(dá)于細(xì)胞核中，陽性高表達(dá)均呈現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒，且顯色清晰。實驗組YB-1、PCNA的陽性表達(dá)率顯著高于對照組癌旁正常肺組織。與相關(guān)文獻[10]研究結(jié)果一致。

表2 YB-1和PCNA陽性表達(dá)及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系/例

表3 胃癌組織中YB-1和PCNA表達(dá)的相關(guān)性分析/例

Xiao等研究結(jié)果表明，YB-1在宮頸癌形成及進展過程中發(fā)揮重要作用，其異常甲基化及失活與患者臨床分期相關(guān)。王國榮等[11]研究表明，YB-1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，表明YB-1可作為一個非獨立影響因素影響胃癌患者的預(yù)后。曾榮華等[12]研究證實，PCNA的表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血管淋巴管的侵犯有關(guān)，可作為腫瘤血管標(biāo)志物對疾病進行預(yù)后判斷。本研究結(jié)果與上述結(jié)果一致，在胃癌組織中YB-1、PCNA陽性表達(dá)與AJCC分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度有相關(guān)性，與患者的年齡、性別無關(guān)。本研究還對YB-1、PCNA的表達(dá)進行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示YB-1、PCNA的表達(dá)呈正相關(guān)，提示2者的表達(dá)具有一定的協(xié)同作用，YB-1蛋白表達(dá)升高可上調(diào)PCNA的表達(dá)，從而促進腫瘤細(xì)胞的增殖，為胃癌的生長和轉(zhuǎn)移提供條件。

綜上，YB-1和PCNA均可作為胃癌的腫瘤標(biāo)志物，且與患者AJCC分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度有相關(guān)性，聯(lián)合檢測可為胃癌的早期診斷、病理分級提供重要參考依據(jù)，進一步探討胃癌發(fā)病機制奠定了基礎(chǔ)，也為臨床抗腫瘤治療提供新方向。