超聲引導(dǎo)在兔膝關(guān)節(jié)出血模型建立中的應(yīng)用

張 峰 ，崔延軍 ，蔣雪梅 ，李建寧 ，張文煥 ，司志雯 ，于明秀 ，劉 斌

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院特檢科，山東 濟(jì)南 250011；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014）

關(guān)節(jié)出血，又稱關(guān)節(jié)血癥，是多種疾病重要的臨床表現(xiàn)，如關(guān)節(jié)內(nèi)骨折、血友病、關(guān)節(jié)炎、色素沉著絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎等［1］，也是導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎的具體病理因素之一，其與一系列的物理（負(fù)荷與運(yùn)動(dòng)）和化學(xué)（各種細(xì)胞因子與酶等）過(guò)程相關(guān)［2］，故建立恰當(dāng)?shù)年P(guān)節(jié)出血模型對(duì)于相關(guān)基礎(chǔ)或臨床研究具有重要價(jià)值。本研究設(shè)計(jì)應(yīng)用超聲引導(dǎo)下關(guān)節(jié)腔注射含有肝素的兔心臟血建立兔膝關(guān)節(jié)出血模型，旨在為今后研究膝關(guān)節(jié)病變提供切實(shí)可行且有效的動(dòng)物模型，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康級(jí)別成年新西蘭大白兔8只，3月齡，性別不限，體質(zhì)量 2.0～2.5 kg，平均（2.29±0.15）kg，由濟(jì)南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（魯）20150001。在濕度45%、室溫25℃的屏障級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)飲食。動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)均在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室完成。

1.2 方法

1.2.1 兔心臟血的配制 取兔稱重后用木制兔盒將其固定，經(jīng)耳緣靜脈緩慢注射10%水合氯醛（3 mL/kg體質(zhì)量），流率2～3 mL/min，待達(dá)到有效麻醉狀態(tài)停止注射；注射過(guò)程中注意觀察睫毛、角膜反射和呼吸頻率；麻醉成功后，將其仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，胸部備皮后予皮膚消毒劑安爾碘消毒，采用含1mL肝素的10 mL注射器于兔心臟取血液10 mL，備用。

1.2.2 關(guān)節(jié)出血模型的制備方法 啟動(dòng)Terason t3000超聲診斷儀，探頭頻率12 MHz，選用骨骼、肌肉低速血流條件，脈沖多普勒取樣容積為1 mm。取兔膝關(guān)節(jié)伸直位，超聲探頭延長(zhǎng)軸在膝關(guān)節(jié)內(nèi)外滑動(dòng)時(shí)，探查髕上囊部位，確定髕上囊后，在探頭邊緣外側(cè)進(jìn)行皮膚消毒，帶無(wú)菌手套，采取平面內(nèi)進(jìn)針技術(shù)，由外向內(nèi)，將穿刺針置入膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，再次超聲確定后，注入上述10 mL含肝素兔心臟血液，每3 d注射1次，2周后對(duì)模型進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)及評(píng)價(jià)。分別于第1、4、7天對(duì)全部動(dòng)物左膝注射兔心臟血，注射后即刻行超聲檢查，所有兔髕上囊均出現(xiàn)液性暗區(qū)。第10、14天不進(jìn)行關(guān)節(jié)注射，僅行超聲檢查。

1.2.3 分組與造模 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用自身對(duì)照，共8只。其中左膝關(guān)節(jié)按照上述步驟進(jìn)行關(guān)節(jié)出血模型制備；右膝關(guān)節(jié)采用同樣方式注射等量的注射用生理鹽水；未設(shè)空白對(duì)照組。

1.3 模型評(píng)價(jià) 觀察動(dòng)物基本情況、死亡數(shù)量。觀察并記錄2組動(dòng)物患肢的局部情況、體溫、體質(zhì)量變化，以及動(dòng)物活動(dòng)及攝食飲水情況等。將全部動(dòng)物處死，取材，取雙膝關(guān)節(jié)置于10%甲醛溶液中固定48 h，沖洗后置復(fù)合脫鈣液中脫鈣24 h，脫水、石蠟包埋切片（縱切厚度5 μm），HE染色，光鏡下觀察新骨形成及骨缺損處血管化情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以±s表示，組間數(shù)據(jù)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況評(píng)價(jià) 全部動(dòng)物均未死亡，造模后兔下肢膝關(guān)節(jié)可見(jiàn)不同程度的軟組織腫脹，跛行、活動(dòng)較前明顯遲緩，但未出現(xiàn)食欲減退、小便清長(zhǎng)、大便稀溏等不良癥狀和感染等嚴(yán)重并發(fā)癥。

兔體溫和體質(zhì)量檢查結(jié)果見(jiàn)圖1，2。在造模過(guò)程中體溫較前未見(jiàn)明顯差異（P＞0.05），但體質(zhì)量較前有所增加（P＜0.05）。

圖1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體溫變化情況 圖2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量變化情況，與第1天比較，*P＜0.05

2.2 超聲檢查結(jié)果 兔髕上囊可見(jiàn)液性暗區(qū)（圖3）；3 d后，兔髕上囊液性暗區(qū)消失或明顯縮?。▓D4）。

動(dòng)物第1次注射兔心臟血或生理鹽水后可見(jiàn)膝關(guān)節(jié)髕上囊充盈，超聲探查示髕上囊5～9 mm深的液性暗區(qū)；第4天第2次注射前膝關(guān)節(jié)無(wú)明顯腫脹，超聲探查示髕上囊未見(jiàn)明顯液性暗區(qū)；第7天第3次注射前膝關(guān)節(jié)無(wú)明顯腫脹，超聲探查示1只兔左膝可見(jiàn)深1.4 mm液性暗區(qū)，1只兔右膝可見(jiàn)深1.2 mm液性暗區(qū)；第10天超聲探查示2只兔左膝可見(jiàn)深1.6 mm、1.8 mm液性暗區(qū)，1只兔右膝見(jiàn)深1.6 mm液性暗區(qū)，余兔膝關(guān)節(jié)髕上囊未見(jiàn)液性暗區(qū)；第14天超聲探查，全部兔膝關(guān)節(jié)髕上囊均未見(jiàn)液性暗區(qū)。

2.3 病理學(xué)檢查結(jié)果 滑膜組織切片HE染色結(jié)果見(jiàn)圖5～7。光鏡下觀察，右側(cè)膝關(guān)節(jié)未見(jiàn)滑膜組織。左側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜局灶性輕度增生；血管擴(kuò)張，血管周?chē)鷿{細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及單核樣巨細(xì)胞灶性浸潤(rùn)；間質(zhì)內(nèi)小淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)并伴含鐵血黃素沉積［（5～15）/40 HPF］，淋巴濾泡形成。

3 討論

關(guān)節(jié)出血可導(dǎo)致關(guān)節(jié)腔的物理容積增加而出現(xiàn)關(guān)節(jié)囊擴(kuò)張，關(guān)節(jié)囊內(nèi)壓力增高使毛細(xì)血管和淋巴管回流受阻、關(guān)節(jié)腫脹，還可引起關(guān)節(jié)腔內(nèi)的炎性細(xì)胞的應(yīng)答，并產(chǎn)生多種細(xì)胞因子。研究［3］表明，A型滑膜細(xì)胞和巨噬細(xì)胞約1周可對(duì)新鮮出血進(jìn)行清除，同時(shí)，紅細(xì)胞中的鐵（即含鐵血黃素）也沉積在滑膜中，而含鐵血黃素可進(jìn)一步加重滑膜增生及滑膜內(nèi)毛細(xì)血管增生，最終形成出血—炎癥—更易出血的惡性循環(huán)。另外，增生滑膜內(nèi)炎性細(xì)胞產(chǎn)生的酶和多種細(xì)胞因子可造成或加重關(guān)節(jié)軟骨的破壞，加重骨的病變，甚至導(dǎo)致關(guān)節(jié)強(qiáng)直、變形，嚴(yán)重影響關(guān)節(jié)功能。關(guān)節(jié)腔內(nèi)出血可造成軟骨細(xì)胞凋亡，其發(fā)生甚至早于滑膜炎癥［4-9］。高頻超聲可顯示關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜病變情況，如滑膜增生、關(guān)節(jié)積液及軟骨損傷等［10］，有利于動(dòng)態(tài)觀察和評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)軟組織的改變。

本研究采用超聲引導(dǎo)下關(guān)節(jié)注射建立兔膝關(guān)節(jié)出血模型。人類的膝關(guān)節(jié)較表淺且解剖結(jié)構(gòu)易于觸摸，盲法穿刺易實(shí)施。然而在兔膝關(guān)節(jié)中，由于關(guān)節(jié)液相對(duì)較少，幾乎無(wú)法抽到關(guān)節(jié)液，若僅依靠穿刺進(jìn)針時(shí)的突破感和注射器推注阻力大小來(lái)判斷，將影響模型的順利建立，也難以保證其重復(fù)性［11-12］。本研究在超聲引導(dǎo)下于膝關(guān)節(jié)伸直位從髕骨外側(cè)緣進(jìn)針，成功率100%，并運(yùn)用超聲進(jìn)行注射后再評(píng)估，使用超聲觀察注射的液體量并留存圖像，便于后期更直觀地觀察和對(duì)比積液的吸收程度及周?chē)浗M織的改變，還可觀察、評(píng)價(jià)滑膜增生程度和滑膜內(nèi)毛細(xì)血管增生情況［13］。

本實(shí)驗(yàn)在討論兔膝關(guān)節(jié)注射量時(shí)考慮兔關(guān)節(jié)腔小，單次注射量不易過(guò)多，所以選定注射10 mL觀察實(shí)驗(yàn)效果。從實(shí)驗(yàn)中3次注射后超聲下觀察可見(jiàn)，75%的兔關(guān)節(jié)液性暗區(qū)消失較快，考慮與兔代謝較快、吸收能力強(qiáng)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)未能在兔膝關(guān)節(jié)髕上囊內(nèi)造成持續(xù)性積液，后期將設(shè)計(jì)多個(gè)注射間隔，并考慮增加注射量以觀察其對(duì)結(jié)果的影響。

本研究病理切片染色顯示，兔心臟血注射側(cè)兔病理組織形態(tài)學(xué)變化存在滑膜局灶性輕度增生且含鐵血黃素沉積，而生理鹽水注射側(cè)未見(jiàn)明顯滑膜增生，說(shuō)明本方法造成關(guān)節(jié)出血模型是切實(shí)可行的。另外，本研究旨在建立有效的關(guān)節(jié)出血?jiǎng)游锬Ｐ停^察關(guān)節(jié)滑膜的病理改變，故僅設(shè)計(jì)注入等量兔心臟血與生理鹽水進(jìn)行對(duì)比觀察，未設(shè)立空白對(duì)照。

目前臨床上對(duì)關(guān)節(jié)出血性疾病的診斷主要依靠MRI檢查［14］、關(guān)節(jié)液穿刺培養(yǎng)檢查及術(shù)中取病灶組織行組織病理學(xué)檢查，缺乏對(duì)其發(fā)病機(jī)制、病因和治療效果相關(guān)指標(biāo)的評(píng)價(jià)，因此，建立切實(shí)可行且穩(wěn)定性好的關(guān)節(jié)出血?jiǎng)游锬Ｐ椭陵P(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)超聲引導(dǎo)下兔心臟血關(guān)節(jié)注射進(jìn)行關(guān)節(jié)出血?jiǎng)游锬Ｐ偷难芯?，并于超聲下觀察注射及吸收情況、滑膜增生情況，完善模型驗(yàn)證指標(biāo)，具有較好的重復(fù)性，特別是使用高頻超聲動(dòng)態(tài)、對(duì)比觀察，可為今后關(guān)節(jié)出血類疾病的病理改變、實(shí)驗(yàn)干預(yù)及后期療效評(píng)價(jià)提供參考。

圖3 關(guān)節(jié)注射后兔髕上囊聲像圖，可見(jiàn)液性暗區(qū) 圖4 關(guān)節(jié)注射3 d后兔髕上囊聲像圖，液性暗區(qū)明顯縮?。^） 圖5～7 分別為HE×10、HE×20滑膜組織切片圖像