血清Semaphorin3A的水平與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女的骨密度和骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)關(guān)系的研究

郭君紅 宋曉婕 周潔瓊 劉麗平 聶華 田萍 徐亮

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院（武漢市婦幼保健院）（武漢 430015）；2長(zhǎng)江航運(yùn)總醫(yī)院武漢腦科醫(yī)院（武漢430000）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一多因素病因引起的慢性進(jìn)展性疾病，以骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)破壞和骨強(qiáng)度下降導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征，其嚴(yán)重并發(fā)癥為骨折[1]，從而影響患者的身心健康及帶來(lái)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，是一較常見的骨代謝疾病。其中絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal os?teoporosis，PMOP）屬原發(fā)性高代謝轉(zhuǎn)換型OP，好發(fā)于絕經(jīng)后的中老年婦女，主要因同時(shí)存在雌激素缺乏、持續(xù)的鈣丟失和骨老化等多因素，骨代謝在絕經(jīng)前后的時(shí)間開始快速丟失，骨吸收量明顯高于骨形成量，致使骨量逐漸丟失、骨密度隨之下降，進(jìn)而發(fā)生高轉(zhuǎn)換型的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥[2]，最后導(dǎo)致骨折風(fēng)險(xiǎn)相應(yīng)增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球60～70歲女性1/3以上患有骨質(zhì)疏松，50歲以上女性有1/3因骨質(zhì)疏松而骨折[3]。預(yù)防和認(rèn)識(shí)骨質(zhì)疏松是減少此種情況影響的一線措施[4]。

健康成人體內(nèi)，成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收維持著正常的骨代謝穩(wěn)態(tài)，骨組織通過不斷地重塑來(lái)保持骨的完整性及礦物質(zhì)的內(nèi)穩(wěn)定，骨骼的自我穩(wěn)態(tài)是在內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫及神經(jīng)系統(tǒng)的多種途徑的調(diào)控下實(shí)現(xiàn)的[5]。骨形成與骨再吸收之間的不平衡可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥等骨代謝疾病[6]。

Semaphorins家族近年來(lái)廣受關(guān)注，具有重要免疫調(diào)控作用的神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子，最初由KOLODKIN等[7]在20世紀(jì)90年代中發(fā)現(xiàn)。日本學(xué)者 TAKAYANAGI等[8]研究發(fā)現(xiàn)該家族成員 sema?phorin3A（Sema3A）可以通過抑制破骨細(xì)胞的骨重吸收和增加成骨細(xì)胞的骨形成來(lái)發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)的骨保護(hù)作用，其實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)semaphorin?3A缺陷小鼠除了會(huì)呈現(xiàn)一種骨質(zhì)破壞的表型，也會(huì)表現(xiàn)出骨合成調(diào)節(jié)因子和成骨細(xì)胞數(shù)量的減少，而靜脈注射semaphorin?3A可以預(yù)防卵巢切除引起的骨丟失。

目前研究人體內(nèi)血清Sema3A的水平與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）婦女的關(guān)系的研究尚少。LIU等[9]研究證實(shí)PMOP婦女的血清sema3A水平與骨形成標(biāo)志物骨鈣素（osteocalcin，OC）呈正相關(guān)（r＝ 0.077，P＝0.025），從而支持sema3A在小鼠研究中的骨保護(hù)作用。而Sema3A水平與骨形成標(biāo)志物I型前膠原氨基端前肽（procollagen type I amino?ter?minalpropeptide，PINP）的關(guān)系研究尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)旨在研究PMOP婦女血清Sema3A的水平與BMD、骨形成標(biāo)志物PINP、骨吸收標(biāo)志物I型膠原交聯(lián)C?末端肽（C?terminal crosslinking of type I collagen，CTX）的相關(guān)性，以進(jìn)一步豐富臨床數(shù)據(jù)庫(kù)，為抗骨質(zhì)疏松藥物的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 病例及標(biāo)本收集2017年1月至2017年12月在本院門診就診的85例PMOP婦女，其絕經(jīng)期在2年以上10年以下，詳細(xì)詢問既往疾病史，排除以下情況：（1）糖尿病、甲亢、惡性腫瘤等影響骨代謝的其他內(nèi)分泌疾病或慢性疾病；（2）受檢前（半年內(nèi)）使用影響骨代謝的藥物如大劑量鈣劑、雌激素、雄激素、二磷酸鹽、皮質(zhì)激素等；（3）近3月內(nèi)采用激素替代治療；（4）既往放療；（5）異常的肝腎功能檢測(cè)。同期收集在本院體檢健康的90例絕經(jīng)后婦女作為對(duì)照組，6個(gè)月內(nèi)未使用過免疫增強(qiáng)或抑制劑，研究前所有受試者均簽署知情同意書。受試者于上午7：30～9：30之間采集空腹靜脈血，分裝入不含抗凝劑的離心試管中并靜置，在1 h內(nèi)以2 000 r/min離心，所得血清置于-80℃冰箱冷凍保存待檢。

1.2 方法

1.2.1 骨密度測(cè)定采用美國(guó)Hologic?QDR?4 500 W雙能X線骨密度儀（dual?energy X?ray ab?sorptiometry，DEXA）進(jìn)行骨密度的測(cè)量，測(cè)定部位為腰椎（L2?4）前后位，每日測(cè)前均行體模測(cè)試，測(cè)量的變異系數(shù)（cv）＜1%。OP診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照國(guó)人OP的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，骨密度低于峰值骨量的2倍標(biāo)準(zhǔn)差以上為骨質(zhì)疏松，骨密度大于峰值骨量的1倍標(biāo)準(zhǔn)差為骨質(zhì)正常。

1.2.2 血清Sema3A的測(cè)定采用Santa Cruz公司的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme?linked immunosor?bent assay，ELISA）試劑盒測(cè)定，最終反應(yīng)板在DYNA TECH?MR500型酶標(biāo)測(cè)定儀于450nm處讀取吸光度（A）值。每例血清樣本皆設(shè)正、副2個(gè)測(cè)試孔，取其平均A值。所測(cè)值按標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成Sema3A含量。

1.2.3 血清I型前膠原氨基端前肽（procollagen type I amino?terminalpropeptide，PINP）、血清I型膠原交聯(lián)C?末端肽（C?terminal crosslinking of type I collagen，CTX）的測(cè)定采用羅氏自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)，試劑由羅氏公司提供，PINP、CTX的批 內(nèi)變異系數(shù)（CV）分別為4.6%、4.0%，PINP、CTX的批間CV均＜6.0%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)；參數(shù)間的相互關(guān)系用直線相關(guān)分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組患者與對(duì)照組的基本特征描述兩組研究人群的一般資料及測(cè)量指標(biāo)見表1。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組和對(duì)照組的年齡、絕經(jīng)年限、身高、體重、BMI無(wú)明顯差異（均P＞0.05）。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組的腰椎BMD（0.845±0.079）g/cm2明顯低于對(duì)照組（1.149±0.069）g/cm2，P＜0.01。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組的血清CTX（0.524±0.026）ng/mL、PINP（54.64± 8.79）ng/mL水平均明顯高于對(duì)照組（0.413±0.025）ng/mL和（45.13±9.16）ng/mL，均P＜0.01。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組的Sema3A（4.20±0.59）ng/mL明顯低于對(duì)照組（6.89±1.06）ng/mL，P＜0.01。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組與對(duì)照組血清鈣、血清磷比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 腰椎BMD與血清CTX、PINP的相關(guān)性直線相關(guān)分析顯示：絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組的腰椎BMD與血清CTX、PINP均呈負(fù)相關(guān)（分別r＝-0.513，r＝-0.236，均P＜ 0.05），對(duì)照組的腰椎BMD與血清CTX、PINP亦均呈負(fù)相關(guān)（分別r＝-0.484，r＝-0.210，均P＜ 0.05）。

表1 兩組人群的一般資料及生化指標(biāo)Tab.1 The general materials and biochemical markers in two groups ±s

表1 兩組人群的一般資料及生化指標(biāo)Tab.1 The general materials and biochemical markers in two groups ±s

變量年齡（歲）絕經(jīng)年限（年）身高（cm）體重（kg）BMI（kg/m2）腰椎 BMD（g/cm2）PINP（ng/mL）CTX（ng/mL）Sema3A（ng/mL）血清鈣（mmol/L）血清磷（mmol/L）絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組（n=85）56.7±6.3 6.5±2.3 155.3±4.8 56.2±7.4 23.0±2.8 0.845±0.079 54.64±8.79 0.524±0.026 4.20±0.59 2.32±0.15 0.98±0.15對(duì)照組（n=90）56.4±6.1 6.7±2.5 155.5±5.0 56.4±7.6 23.2±3.0 1.149±0.069 45.13±9.16 0.413±0.025 6.89±1.06 2.34±0.17 1.04±0.13 P值0.745 0.18 0.245 0.741 0.196＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＞0.05＞0.05

2.3 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組血清Sema3A水平與各參數(shù)間的相關(guān)性85例絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女的血清Sema3A水平與腰椎BMD值呈顯著正相關(guān)（r＝0.598，P＜0.01），與骨吸收指標(biāo)CTX值呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝-0.629，P＜0.01），與骨形成指標(biāo)PINP值呈較弱負(fù)相關(guān)（r＝-0.158，P＜ 0.05）。血清Se?ma3A水平與患者的年齡、BMI之間無(wú)相關(guān)性（均P＞0.05）。見表2。

表2 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女血清Sema3A水平與各參數(shù)間的相關(guān)性Tab.2 The association between serum Sema3A level and parameters

3 討論

3.1 BMD與血清CTX、PINP的關(guān)系骨密度，即單位體積或單位面積的骨量，是人體骨骼強(qiáng)度的重要指標(biāo)。能夠準(zhǔn)確反應(yīng)骨質(zhì)疏松的程度[11]。骨密度測(cè)量方法較多，DEXA法測(cè)定的骨密度是全球公認(rèn)的OP診斷金標(biāo)準(zhǔn)。本研究采用DEXA骨密度儀測(cè)量絕經(jīng)后女性腰椎（L2～L4）骨密度，結(jié)果顯示絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組腰椎（L2～L4）骨密度明顯低于對(duì)照組（P＜0.01）。骨代謝生化指標(biāo)是骨組織本身的代謝（分解與合成）產(chǎn)物，分為骨形成標(biāo)志物和骨吸收標(biāo)志物，前者反映成骨細(xì)胞活性及骨形成狀態(tài)，后者代表破骨細(xì)胞活性及骨吸收水平[12]。骨代謝生化指標(biāo)靈敏度高、易于檢測(cè)，獨(dú)立于年齡、骨密度等骨質(zhì)疏松性骨折的風(fēng)險(xiǎn)因素，通過反映全身骨代謝的變化而反映骨質(zhì)疏松性骨折的風(fēng)險(xiǎn)[13]。β?CTX和 PINP是國(guó)際骨質(zhì)疏松癥基金會(huì)推薦使用的骨代謝指標(biāo)。CTX反映破骨細(xì)胞的活性，是敏感特異的骨吸收標(biāo)志物[14]，PINP反映成骨細(xì)胞的活性，是敏感而特異性強(qiáng)的骨形成指標(biāo)[15]。聯(lián)合檢測(cè)骨形成和骨吸收指標(biāo)能對(duì)骨轉(zhuǎn)換進(jìn)行分型，預(yù)測(cè)骨丟失率，可用于鑒別個(gè)體是否存在快速骨丟失及易患骨質(zhì)疏松，選擇恰當(dāng)?shù)母深A(yù)措施。本研究顯示絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女骨吸收指標(biāo)CTX水平與骨形成指標(biāo)PINP水平均高于正常對(duì)照組，B M D與CTX和PINP成負(fù)相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道[16]相近。反映了絕經(jīng)后患者的骨代謝中破骨細(xì)胞活動(dòng)加強(qiáng)，骨轉(zhuǎn)換增加，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生可能是骨吸收的速度超過骨形成的速度所致，骨形成的增加繼發(fā)于骨吸收的增加，是機(jī)體代償?shù)慕Y(jié)果，這不同于老年性骨質(zhì)疏松癥。

3.2 血清Sema 3A與BMD、血清CTX、PINP的關(guān)系Sema3A是一種可溶性Ⅲ類軸突導(dǎo)向蛋白成員，其僅在成骨細(xì)胞中表達(dá)，與其受體神經(jīng)纖毛蛋白1（neuropilin?1，NRP1）一起參與軸索導(dǎo)向及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等各種生理過程。研究TAKAYANAGI等[8]發(fā)現(xiàn)Sema3A可對(duì)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞進(jìn)行雙重調(diào)節(jié)，Sema3a-/-小鼠和NrpISema?小 鼠（表達(dá)的NRP1缺乏Sema結(jié)合位點(diǎn)）有嚴(yán)重的骨病，表現(xiàn)為破骨細(xì)胞數(shù)量增加和成骨細(xì)胞數(shù)量減少。重組Sema3A經(jīng)靜脈注射至正常小鼠，可導(dǎo)致破骨細(xì)胞減少和成骨細(xì)胞增加，促進(jìn)骨量積累。此外，用Sema3A治療鉆洞損傷誘導(dǎo)的小鼠骨缺損模型，可促進(jìn)骨再生，并降低去勢(shì)小鼠的骨質(zhì)流失。作為目前發(fā)現(xiàn)的唯一可對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞進(jìn)行雙重調(diào)節(jié)的信號(hào)通路，Sema3A/Nrp1對(duì)受損骨神經(jīng)的軸突再生、骨骼發(fā)育和骨重建具有調(diào)控作用，在骨形成和骨吸收過程中具有重要意義[17-18]。

Sema3A對(duì)骨代謝的作用已得到研究的證明，但檢測(cè)PMOP婦女血清中Sema3A的水平與骨代謝的國(guó)內(nèi)外臨床實(shí)驗(yàn)的研究尚少。LIU等[9]研究證實(shí)PMOP婦女的血清sema3A水平與骨形成標(biāo)志物OC呈正相關(guān)，從而支持sema3A在小鼠研究中的骨保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組血清Sema3A明顯低于對(duì)照組，并且Sema3A水平與BMD呈正相關(guān)，與骨吸收指標(biāo)CTX水平呈負(fù)相關(guān)，Sema3A與患者年齡、BMI間無(wú)相關(guān)性，表明Se?ma3A可能參與了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)病過程，在骨轉(zhuǎn)換中發(fā)揮作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Sema3A對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的雙重調(diào)節(jié)的分子機(jī)制。叢狀蛋白A（PlexinA）家族是Sema3A的主要受體，它和Nrpl形成受體復(fù)合物。PlexinAl在髓系細(xì)胞觸發(fā)受體 2（triggering receptor expressed on myeloidcells?2，TREM2）和自然殺傷激活受體相關(guān)蛋白12（DNAX?activating protein of 12 kU，DAPl2）形成PlexnAl?TREM2?DAPl2復(fù)合體，為破骨細(xì)胞分化提供共刺激信號(hào)。Sema3A?Nrpl軸通過干擾PlexinAl和TREM2?DAPl2的相互結(jié)合來(lái)抑制RANKL誘導(dǎo)下的破骨細(xì)胞分化[19]，而破骨細(xì)胞分化及功能成熟，必須依賴于RANKL?RANK通路的激活。RANKL蛋白通過特異性結(jié)合破骨前體細(xì)胞膜上的RANK受體，促發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過激活下游TRAF6?NF?κB和AP?1轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體（包括c?Fos）兩條通路，從而激活活化T細(xì)胞核因子1蛋白（NFAT?cl），促進(jìn)破骨細(xì)胞特異性基因ctsk、Acp5和Nfatcl表達(dá)，誘導(dǎo)前體細(xì)胞向成熟的有功能的破骨細(xì)胞分化。此外，Sema3A?Nrpl軸還可抑制RhoA的激活來(lái)阻止破骨前體細(xì)胞的分化。另外HAYASHI等[8]還發(fā)現(xiàn)，sema3A能抑制巨噬細(xì)胞集落刺激因子對(duì)骨髓源性單核／巨噬前體細(xì)胞的趨化作用，從而防止該細(xì)胞向骨吸收區(qū)遷移，減少對(duì)骨質(zhì)破壞；Sema3A通過經(jīng)典的Wnt?β?鏈蛋白信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化[20]。經(jīng)典Wnt通路是促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的重要信號(hào)通路，其主要通過激活Racl表達(dá)，使β?catenin即β鏈蛋白在胞核內(nèi)定位實(shí)現(xiàn)。sema3A與成骨細(xì)胞中的受體結(jié)合后可借助FARP2（一種鳥嘌呤核苷酸交換因子）上調(diào)Racl的表達(dá)，使β鏈蛋白在胞核內(nèi)聚集，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化及功能成熟。

本研究顯示絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者的血清Se?ma3A水平降低，使成骨細(xì)胞活性減弱，破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，骨形成減低，骨吸收增加，骨量減少導(dǎo)致BMD降低。Sema3A水平降低可能是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生的重要原因之一。表明Sema3A在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松中的正性調(diào)節(jié)作用，對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的治療提供了新思路，并且外周血Sema3A水平反映了骨丟失的嚴(yán)重性，可用于監(jiān)測(cè)治療骨質(zhì)疏松藥物的效果。而Sema3A水平與骨形成指標(biāo)PINP水平亦呈負(fù)相關(guān)，后者可能由于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女的高骨轉(zhuǎn)換率，機(jī)體代償性骨形成增加導(dǎo)致。