ESAT?6和CFP?10在感染性脊椎炎鑒別診斷中的作用

孫宇鵬 何少波 張春強(qiáng) 杜開(kāi)利 郭培宇 趙潤(rùn)民

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科（昆明 650032）

脊椎炎（VO）是一種以特定病原微生物引起，累及椎體、椎間盤及椎體周圍組織的感染性疾病，可由血液傳播、相鄰軟組織感染擴(kuò)散或脊柱外科手術(shù)中直接感染導(dǎo)致[1]，在發(fā)達(dá)國(guó)家年發(fā)病率為2.9～ 5.4/10萬(wàn)，其中年齡＜ 59歲占49.5%[2]。在我國(guó)，大部分脊椎炎的病例被診斷為脊柱結(jié)核感染，但仍存在較高的誤診率。結(jié)核感染T細(xì)胞試驗(yàn)（T?SPOT.TB）是近年應(yīng)用于結(jié)核病臨床診斷的重要方法，其使用的特異性抗原6 kD早期分泌靶向抗原（ESAT?6）和10 kD培養(yǎng)濾過(guò)蛋白（CFP?10）均不存在于卡介苗開(kāi)放讀碼框中，因此不受卡介苗影響從而大大提高M(jìn)TB感染的檢出率，目前國(guó)內(nèi)外許多研究證實(shí)T?SPOT.TB在診斷結(jié)核感染中具有較高的敏感度及特異度[3]。該方法以特異性抗原ESAT?6、CFP?10為刺激源，檢測(cè)外周血中釋放IFN?γ的特異性T細(xì)胞數(shù)量從而判斷是否為MTB感染。結(jié)果由ESAT?6、CFP?10斑點(diǎn)計(jì)數(shù)決定，其中任意一個(gè)抗原斑點(diǎn)計(jì)數(shù)結(jié)果判定為陽(yáng)性，則T?SPOT.TB結(jié)果為陽(yáng)性。但在兩種抗原刺激下，分泌IFN?γ的T細(xì)胞數(shù)量并不一樣，便出現(xiàn)了兩種抗原診斷結(jié)果不一致的情況。且T?SPOT.TB目前主要運(yùn)用于肺結(jié)核領(lǐng)域，在脊柱結(jié)核病中的研究報(bào)道較少，且 T?SPOT.TB結(jié)果中ESAT?6、CFP?10在不同類型感染性脊椎炎鑒別診斷中的作用和效率相關(guān)研究較少。本研究通過(guò)脊椎炎患者外周血檢測(cè)T?SPOT.TB結(jié)果中ESAT?6、CFP?10斑點(diǎn)計(jì)數(shù)進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)兩種抗原在各種不同類型的脊椎炎鑒別診斷的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料資料來(lái)源于2014年7月至2017年7月就診于我院脊柱外科，根據(jù)臨床表現(xiàn)、一般實(shí)驗(yàn)室檢查、感染相關(guān)指標(biāo)檢查及影像學(xué)檢查，并最終通過(guò)血培養(yǎng)、病理組織學(xué)和膿液培養(yǎng)等手段明確病原學(xué)診斷患者共59例。見(jiàn)表1。

表1 59例脊椎炎患者一般資料及其T?SPOT.TB結(jié)果Tab.1 59 cases of patients with general information and their T?SPOT.TB results±s

表1 59例脊椎炎患者一般資料及其T?SPOT.TB結(jié)果Tab.1 59 cases of patients with general information and their T?SPOT.TB results±s

例數(shù)T?STOP.TB ESAT?6CFP?10陽(yáng)性例數(shù)項(xiàng)目性別男女年齡35 24 14.62±32.08 34.12±32.00 33.14±55.17 28.41±40.80 19 18＜30 30～60≥60病變部位頸椎胸椎胸腰椎腰椎病種結(jié)核性脊椎炎布魯氏菌性脊椎炎化膿性脊椎炎13 36 10 25.84±26.47 20.91±33.89 24.20±40.96 55.69±62.46 23.83±45.22 26.00±38.97 11 21 150 18 4 36 41.16±42.95 11.50±6.60 15.40±26.09 48.83±57.51 97.75±81.44 16.34±31.14 5 0 1 5 4 1 8 38 11 10 34.23±36.47 2.54±3.90 0.20±0.42 48.02±55.00 1.27±1.34 0.3±0.67 35 20

1.2 T?SPOT.TB檢測(cè)方法及結(jié)果判定采用Ox?ford Immunotec公司T?SPOT.TB試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書正確操作。陽(yáng)性結(jié)果判定：空白對(duì)照斑點(diǎn)數(shù)≤5時(shí)，A抗原或B抗原斑點(diǎn)計(jì)數(shù)-空白對(duì)照孔斑點(diǎn)計(jì)數(shù)≥6；空白對(duì)照孔斑點(diǎn)計(jì)數(shù)6～10個(gè)時(shí)，A抗原（ESAT?6）或B抗原（CFP?10）孔斑點(diǎn)數(shù)≥2×空白對(duì)照孔斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。如不符合上述標(biāo)準(zhǔn)且陽(yáng)性質(zhì)控對(duì)照孔正常時(shí)檢測(cè)結(jié)果為陰性。空白對(duì)照孔斑點(diǎn)計(jì)數(shù)超過(guò)10個(gè)時(shí)、陽(yáng)性質(zhì)控對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)小于20個(gè)時(shí)，檢測(cè)結(jié)果被認(rèn)為是“不確定”。T?SPOT.TB檢測(cè)操作及結(jié)果判讀由同一位醫(yī)師完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析并繪制ROC曲線，計(jì)量資料用表示，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；一致性檢驗(yàn)采用kappa分析，率的比較采用McNemer檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用GraphPad Prism 7.0繪制散點(diǎn)圖并進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 T?SPOT.TB結(jié)果38例結(jié)核性脊椎炎組患者中有35例陽(yáng)性，21例非結(jié)核性脊椎炎組中2例結(jié)果為陽(yáng)性，該2例患者最終明確診斷為布魯氏菌性脊椎炎。T?SPOT.TB檢測(cè)靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為92.10%、90.47%、94.59%、86.36%。T?SPOT.TB檢測(cè)在結(jié)核性脊椎炎與非結(jié)核性脊椎炎陽(yáng)性檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=39.445，P=0.00）（表2）。

37例陽(yáng)性結(jié)果中，僅ESAT?6陽(yáng)性7例，僅CFP?10陽(yáng)性3例，ESAT?6、CFP?10均陽(yáng)性27例。繪制59例脊椎炎患者ESAT?6、CFP?10斑點(diǎn)計(jì)數(shù)散點(diǎn)圖（圖1），最終診斷為非結(jié)核脊椎炎病例2例陽(yáng)性患者結(jié)果均為僅ESAT?6陽(yáng)性（2例ESAT?6/CFP?10斑點(diǎn)數(shù)分別為11/1和9/1）。

表2 結(jié)核性脊柱炎與非結(jié)核性脊柱炎卡方檢驗(yàn)Tab.2 The chi?square test results of TVO and non?TVO

對(duì)38例結(jié)核患者T?SPOT.TB結(jié)果中ESAT?6、CFP?10斑點(diǎn)計(jì)數(shù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（圖2），ESAT?6及CFP?10斑點(diǎn)計(jì)數(shù)在結(jié)核性脊椎炎患者中差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.288，P=0.201）。

2.2 ROC曲線分析ESAT?6、CFP?10 對(duì)59例T?SPOT.TB結(jié)果ESAT?6、CFP?10斑點(diǎn)計(jì)數(shù)進(jìn)行ROC曲線分析，ESAT?6、CFP?10曲線下面積分別為0.954、0.893。均取斑點(diǎn)計(jì)數(shù)≥6的最小坐標(biāo)點(diǎn)（ESAT?6斑點(diǎn)計(jì)數(shù) =6.5、CFP?10斑點(diǎn)計(jì)數(shù) =7），ESAT?6敏感度與特異度分別為0.842、0.905（Youden index=0.747），CFP?10敏感度及特異度分別為0.763、1.000（Youden index=0.690）（圖3）。

圖1 59例脊椎炎患者ESAT?6、CFP?10斑點(diǎn)計(jì)數(shù)散點(diǎn)圖Fig.1 The scatter diagram of ESAT?6 and CFP?10 spot counts by 59 cases of patients with VO

圖2 結(jié)核性脊柱炎（n=38）ESAT?6、CFP?10斑點(diǎn)計(jì)數(shù)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)Fig.2 The t?test results of ESAT?6 and CFP?10 by patients with TVO（n=38）

2.3 ESAT?6、CFP?10與病原學(xué)診斷結(jié)果一致性分析ESAT?6斑點(diǎn)計(jì)數(shù)McNemer結(jié)果顯示與病原學(xué)診斷結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.289），診斷存在一致性（kappa=0.716，P′＜0.05），但病原學(xué)診斷結(jié)果一致性一般；CFP?10斑點(diǎn)計(jì)數(shù)McNemer結(jié)果顯示與病原學(xué)診斷結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.008），且CFP?10診斷陽(yáng)性率明顯較差，為50.8%（30/59），診斷結(jié)果存在一致性（kappa=0.727，P′＜0.05），與病原學(xué)診斷結(jié)果一致性一般。ESAT?6與CFP?10進(jìn)行kappa一致性分析，McNemer結(jié)果顯示診斷情況一樣（P=0.344），一致性一般（kappa=0.660，P＜0.05）（表3）。

3 討論

各種類型的脊椎炎因?yàn)槠鸩‰[匿、臨床癥狀不典型，早期診斷及鑒別診斷一直困擾著外科醫(yī)生。盡管隨著影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)室檢查的發(fā)展，但脊椎炎的早期診斷及鑒別診斷依然較為困難，極易誤診。脊椎炎可發(fā)生于各年齡段，呈現(xiàn)雙峰分布，第一個(gè)高峰于20歲左右，第二個(gè)高峰出現(xiàn)在50～70歲，男女比例在為2∶1到5∶1之間[4]。疼痛為典型首發(fā)癥狀，其癥狀取決于病變位置，化膿性脊椎炎腰椎病變較為常見(jiàn)，其次是胸椎，頸椎較少見(jiàn)，90%結(jié)核性脊椎炎發(fā)生在胸和腰椎[5]。隨著抗生素的普及和應(yīng)用，脊椎炎的發(fā)病率正在上升。但隨著卡介苗的接種及抗結(jié)核藥物的使用，非特異性脊椎炎發(fā)病率明顯高于結(jié)核性脊椎炎，且非特異性脊椎炎發(fā)病率超過(guò)結(jié)核性脊椎炎的3倍[6]。

圖3 59例患者ESAT?6、CFP?10斑點(diǎn)計(jì)數(shù)ROC曲線分析Fig.3 The ROC curve analysis of ESAT?6 and CFP?10 spot counts

表3 ESAT?6、CFP?10與診斷結(jié)果一致性分析Tab.3 The consistency analysis of two antigens and consistency analysis

MRI敏感性及診斷正確率較高，典型結(jié)核性脊椎炎MRI中，病變椎體T1WI呈現(xiàn)均勻低信號(hào)，T2WI呈現(xiàn)不均勻高信號(hào)[8]。但大多數(shù)結(jié)核性脊椎炎患者的MRI為非典型表現(xiàn)。因此，臨床表現(xiàn)及影像學(xué)檢查較難區(qū)分不同類型的脊椎炎。而較為常用的實(shí)驗(yàn)室檢查區(qū)分不同類型的脊椎炎敏感性較低、特異度較差，血、膿液培養(yǎng)檢出率較低，活檢為有創(chuàng)操作存在一定風(fēng)險(xiǎn)，因此靈敏度及特異度均較好的T?SPOT.TB引入我國(guó)后便迅速?gòu)V泛應(yīng)用于臨床。

T?SPOT.TB在結(jié)核性脊椎炎中的敏感度、特異度報(bào)道不一，敏感度為77%～91%，特異度為77%～94%[9-14]。但研究資料多為結(jié)核性脊椎炎患者與健康患者，并不能體現(xiàn)T?SPOT.TB及結(jié)果中ESAT?6、CFP?10在脊椎炎鑒別診斷中應(yīng)用價(jià)值。因此本研究中59例均為脊椎炎確診患者，其敏感度及特異度為92.10%、90.47%。特異性與大多數(shù)研究結(jié)果一致，而敏感度稍高，可能與本組樣本量較少有關(guān)。

從兩種抗原斑點(diǎn)計(jì)數(shù)的散點(diǎn)圖可知，ESAT?6分布較為集中，而CFP?10分布較為分散，未出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，提示了ESAT?6可能具有較高的敏感度，而CFP?10具有較高的特異度。因此，本研究進(jìn)一步進(jìn)行了ESAT?6及CFP?10斑點(diǎn)計(jì)數(shù)的ROC曲線分析，結(jié)果顯示無(wú)論是 ESAT?6、CFP?10在ROC曲線分析中均具有較高的敏感度和特異度。因此，ESAT?6、CFP?10斑點(diǎn)計(jì)數(shù)結(jié)果可較為靈敏的鑒別結(jié)核及非結(jié)核性脊椎炎。但ESAT?6具有較高的靈敏度而CFP?10具有較高的特異度，這也與前面散點(diǎn)圖分析結(jié)果相一致。同時(shí)也和2例假陽(yáng)性患者T?SPOT.TB結(jié)果中CFP?10正確報(bào)告為真陰性而ESAT?6報(bào)告假陽(yáng)性相符合。而在一致性分析中，ESAT?6與病原學(xué)診斷結(jié)果一致性較好，而CFP?10正確診斷陽(yáng)性率稍差為50.8%，這可能與CFP?10具有較高的特異性有關(guān)。

盡管T?SPOT.TB敏感度及特異度較好，但仍存在一些缺點(diǎn)：（1）ESAT?6及 CFP?10主要存在于MTB復(fù)合群，但仍然存在于少數(shù)非結(jié)核分枝桿菌中，如堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌、轉(zhuǎn)黃分枝桿菌和胃分枝桿菌，因此T?SPOT.TB并不能區(qū)分上面幾種非結(jié)核分枝桿菌感染。（2）T?SPOT.TB并不能區(qū)分MTB攜帶者和MTB感染者[13]，且潛伏性結(jié)核感染斑點(diǎn)數(shù)有可能高于活動(dòng)性結(jié)核，原因可能是：（1）潛伏性結(jié)核感染者免疫功能較好，少量的抗原刺激便激發(fā)了出活躍的保護(hù)性免疫；（2）活動(dòng)性結(jié)核患者免疫功能低下，大量抗原刺激也不足以激起有效的細(xì)胞免疫。這也解釋了本研究中有假陽(yáng)性的結(jié)果出現(xiàn)，可能為MTB攜帶者的兩例布魯氏菌性脊椎炎患者導(dǎo)致敏感度較高的ESAT?6呈現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。而相比之下敏感度較低、特異度較高的CFP?10在可能為攜帶者的兩例布魯氏菌性脊椎炎中沒(méi)有出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，但也因此可能導(dǎo)致了CFP?10在本研究中呈現(xiàn)了假陰性率較高、與病原學(xué)診斷一致性較差且可信度相對(duì)較低的結(jié)果。

綜上所述，ESAT?6具有較高的敏感度，且與病原學(xué)診斷結(jié)果情況一致性較好。并且具有較高的可信度應(yīng)用于各種類型脊椎炎的鑒別診斷中。因本組病例較少，當(dāng)ESAT?6斑點(diǎn)計(jì)數(shù)較高但CFP?10斑點(diǎn)計(jì)數(shù)較低時(shí)是否可以排除結(jié)核性脊椎炎，有待大數(shù)據(jù)ROC曲線進(jìn)一步研究。