3種不同的HPV型別宮頸癌細(xì)胞株分泌蛋白非標(biāo)記定量技術(shù)分析

郝 軼，袁建林，肖 悅，李 卉，郭 霞，*

（1. 南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳518100；2. 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，新疆烏魯木齊 830011；3. 新疆醫(yī)科大學(xué)地方病分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830011）

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)，每年約有52萬新發(fā)病例[1]。雖然如今宮頸癌的篩查手段不斷提高，但是在全世界女性中，宮頸癌仍是第二常見的惡性腫瘤。宮頸癌也是在發(fā)展中國家導(dǎo)致女性死亡的第三大癌癥，嚴(yán)重威脅女性的健康和生命安全[1]。目前，高危型人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的持續(xù)感染已被確定為宮頸癌的一個(gè)重要致病因素，其中HPV16導(dǎo)致的宮頸癌占總體一半以上，病理類型通常為鱗狀上皮細(xì)胞癌。因此本研究中，選取HPV16陽性的宮頸癌鱗狀細(xì)胞株SiHa和人宮頸癌腸轉(zhuǎn)移細(xì)胞Caski，以及HPV16陰性細(xì)胞C33作為研究對象，從3類細(xì)胞株的分泌蛋白為切入點(diǎn)，采取非標(biāo)記(label-free)定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，以尋找明確的分泌蛋白腫瘤標(biāo)記物為目的，為宮頸鱗癌的早期診斷提供更多依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 主要試劑

DEME基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶和100×青霉素-鏈霉素混合溶液(青霉素10 kU/mL，鏈霉素10 mg/mL)，購于美國Gibco公司；BCA試劑盒、三羥甲基氨基甲烷、上樣緩沖液、制膠試劑盒、考馬斯亮藍(lán)，購于美國Bio-Rad公司；二硫蘇糖醇DTT、乙酸、尿素、碳酸氫銨、甲醇、乙腈，均購于美國Sigma公司。

1.2 主要儀器

垂直電泳儀(SE260，GE-Healthcare)；Q-exacitve質(zhì)譜儀和Easy-nLC 1000納升級(jí)液相色譜(Thermo Finnigan)；Trap column固相萃取柱、EASY column SC001 traps 150 μm× 20 mm(RP-C18) 和Analysis column，EASY column SC200 150 μm×100 mm (RP-C18)(均為Thermo)；3 kD超濾(Millipore)；Maxquant，1.3.0.5版本；Perseus軟件，1.3.0.4版本。

1.3 宮頸癌細(xì)胞的培養(yǎng)和收集

SiHa、Caski以及C33細(xì)胞為液體培養(yǎng)狀態(tài)，來自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。先將3種細(xì)胞分別培養(yǎng)在直徑100 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入10 mL左右含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)。根據(jù)報(bào)道[2]，37 ℃無血清培養(yǎng)24 h、細(xì)胞匯合度60%~70%是研究分泌蛋白質(zhì)組的最佳培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)條件[2]。在上述條件下將細(xì)胞培養(yǎng)至匯合度為60%~70%后，用無血清培養(yǎng)基洗4次，37 ℃孵育24 h。收集無血清培養(yǎng)基，0.22 μm孔徑濾膜過濾去除死細(xì)胞和大的細(xì)胞碎片，加入cocktail蛋白酶抑制劑，并用3 kD超濾管Millipore(cut off：5 kD)超濾濃縮、離心，上清保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 蛋白質(zhì)的SDS-PAGE和FASP酶解

BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。通過蛋白質(zhì)的SDSPAGE電泳實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證每個(gè)樣本的蛋白質(zhì)質(zhì)量，每組樣品各取20 μg蛋白質(zhì)樣品5∶1(V/V)加入5×上樣緩沖液，沸水浴5 min，14 000 g離心10 min取上清，進(jìn)行12.5% SDS-PAGE電泳。電泳條件為恒流15 mA，電泳時(shí)間60 min。考馬斯亮藍(lán)染色。接著每份樣品分別取100 μg，分別加入DTT至終濃度為100 mmol/L，之后和200 μL UA buffer (8 mol/L Urea，150 mmol/L Tris-HCl pH8.0) 混勻，轉(zhuǎn)入30 kD超濾離心管，14 000 g離 心15 min。加入200 μL UA buffer離心14 000 g 15 min，棄濾液。加入100 μL IAA (50 mmol/L IAA in UA)14 000 g離心10 min重復(fù)2次。加入100 μL NH4H CO3buffer，離心14 000 g 10 min重復(fù)2次。加入40 μL Trypsin buffer(取2 μg胰酶溶于40 μL NH4H CO3緩沖液)，600 r/min振蕩1 min，37 ℃、16~18 h。換新收集管，14 000 g離心10 min，收集濾液，濾液C18-SD Extraction Disk Cartridge脫鹽處理，紫外分光光度計(jì)測量樣品在280 nm波長的吸光度。

1.5 酶解產(chǎn)物的LC-MS/MS分析

按照定量結(jié)果各取3 μg酶解后產(chǎn)物進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS )分析[2-3]，每個(gè)樣品進(jìn)行3次。采用納升流速HPLC液相系統(tǒng)EASY-nLC1000進(jìn)行分離。液相A液為0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈為2%)，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈為84%)。色譜柱SC200 150 μm× 100 mm(RP-C18)以100%的A液平衡。樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到色譜柱SC001 traps 150 μm× 20 mm (RPC18)再經(jīng)色譜柱分離，流速為300 nL/min。相關(guān)液梯度如下：第0~100 m in，B液線性梯度從0~45%；第100~108 min，B液線性梯度從45%~100%；第108~200 min，B液維持在100%。酶解產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析120 min。檢測方式用正離子，母離子掃描范圍是300~1800 m/z，多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比按照每次全掃描(full scan)后采集20個(gè)碎片圖譜(MS2 scan，HCD)。MS1在M/Z 200時(shí)分辨率為70 000 PPI，MS2在M/Z 200 時(shí)分辨率為17 500 PPI。

1.6 Maxquant的非標(biāo)記分析和Perseus的統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息分析

9個(gè)LC-MS/MS原始文件導(dǎo)入Maxquant軟件(版本號(hào)1.3.0.5)進(jìn)行查庫，進(jìn)行LFQ非標(biāo)定量分析[2-3]。數(shù)據(jù)庫為uniprot human_151619_20160229.fasta(收錄序列151 619條，下載于2016-02-29)。Maxquant所得的查庫文件使用Perseus軟件進(jìn)行分析，Perseus軟件版本號(hào)為1.3.0.4。Maxquant的非標(biāo)記分析等步驟進(jìn)行l(wèi)abel free 定量技術(shù)分析[4-5]，再比較C-33A、SiHa、Caski細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌蛋白的表達(dá)差異，用GO分析(主要為level2分析，二級(jí)分支CC、BP、MF)和KEGG進(jìn)行生物信息分析。

2 結(jié) 果

2.1 蛋白質(zhì)濃度測定

在各樣品均取總量為200 μL的基礎(chǔ)上，蛋白質(zhì)濃度測定結(jié)果為Siha細(xì)胞株為1.2 μg/μL，Caski細(xì)胞株為3.9 μg/μL ，C33細(xì)胞株為3.8 μg/μL。

2.2 SDS-PAGE分析

由考馬斯染色圖譜(圖1)來看，Marker條帶均一，各樣品條帶分離清晰，蛋白提取效果良好。

2.3 肽段及蛋白質(zhì)結(jié)果

肽段樣品在波長280 nm處進(jìn)行吸光度值測定，Siha濃度為0.72 μg/μL ，Caski濃度為0.76 μg/μL，C33為1.27 μg/μL。LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)共鑒定肽段數(shù)21 609個(gè)，蛋白數(shù)2 895個(gè)。蛋白質(zhì)從屬示意圖如圖2所示，其中特異性蛋白C33細(xì)胞有859種，Caski 細(xì)胞有143種，Siha細(xì)胞有128種；發(fā)現(xiàn)3種宮頸癌細(xì)胞株共性蛋白共729種，占29.2%。

對于729種共性蛋白進(jìn)行分析，有以下4類較為集中的類型：①熱休克蛋白類(heat shock，HSPs)。發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白及其相關(guān)蛋白共14種，分別為HSP13、HSP74、HSP76、HSP7C、HSPB1、HS90A、HS90B、HS105、 CDC37、 CH10、 CH60、 GRP75、 GRP78、Q59EJ3， 其 中 屬 于 HSP70家 族 的 有 7種 (HSP13、HSP74、 HSP76、 HSP7C、 GRP75、 GRP78、Q59EJ3)， HSP90有 3種 (HS90A、 HS90B、 CDC37)，HSP60有1種(CH60)。②異質(zhì)性核糖核蛋白類(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，HNRP)。發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性核糖核蛋白類共8種，分別為：ROA1、ROA2、ROA3、 HNRPU、 HNRPD、 G3V4C1、 Q53F64、Q6IBN1。③層黏連蛋白類(laminin，LN)。發(fā)現(xiàn)層 黏 連蛋白類共4種，分別為LAMA5、LAMB2、LAMC1、G3XAI2。④阿爾多酮還原酶(Aldo-keto reductase family 1，AKR1)：發(fā)現(xiàn)阿爾多酮還原酶共2種，分別是ALDR和AK1BA。

深灰圓圈代表C33細(xì)胞株分泌蛋白，白色圓圈代表Caski細(xì)胞株分泌蛋白，淺灰色圓圈代表Siha細(xì)胞株分泌蛋白；各個(gè)圈相交部分表示對應(yīng)細(xì)胞株共同的分泌蛋白.

2.4 GO分析

將已鑒定的蛋白進(jìn)行GO二級(jí)分類統(tǒng)計(jì)圖(level 2，分為CC、BP、MF)分析。如下圖3所示，按照細(xì)胞組分及元件(cellular component，CC)分類，主要包括組成細(xì)胞(cell，>80%)、細(xì)胞器(organelle，>80%)、細(xì)胞外區(qū)(extracellular region)和細(xì)胞膜(membrane)；按照生物過程(biological process，BP)分類，主要包括參與細(xì)胞加工過程(cellular process，>80%)、單一的生物過程(single-organism process)、代謝過程(metabolic process)以及生物調(diào)節(jié)過程(biological regulation)的蛋白質(zhì)；按照分子機(jī)制(molecular function，MF)分類，主要包括結(jié)合蛋白(binding，>80%)和具有催化活性(catalytic activity)的蛋白質(zhì)。

2.5 KEGG pathway分析

如圖4所示，在KEGG Pathway分析中3種類型細(xì)胞

3 GO level2

圖 二級(jí)分類統(tǒng)計(jì)圖( )分析圖株內(nèi)蛋白主要的代謝通路是溶酶體通路(lysosome，39種)，其次為碳代謝(carbon metabolism，30種)、內(nèi)吞作用(endocytosis，30種)等。

圖中X軸代表蛋白可能參與的通路名稱，Y軸代表參與該通路的蛋白數(shù)目，由圖可得出參與溶酶體通路(lysosome)的蛋白數(shù)最多.圖4 KEGG pathway分析

3 討 論

宮頸癌作為最常見的婦科惡性腫瘤，當(dāng)前仍然是嚴(yán)重威脅廣大婦女身心健康的惡性疾病。有研究表明，高危型人體乳頭瘤病毒(high risk HPV)的持續(xù)感染是公認(rèn)的導(dǎo)致宮頸癌的首要因素[6]。迄今已確定基因組全序列的HPV基因型有170多種[7]，已證明其中30種HPV基因型與生殖系統(tǒng)疾病相關(guān)，20余種與宮頸腫瘤相關(guān)。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer， IA RC)對已發(fā)表的85份研究中的10 058例子宮頸癌病例進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)超過2/3的子宮頸癌病例與HPVl6型(51.0%)或HPVl8型(16.2%)感染有關(guān)。HPV 感染與組織學(xué)類型相關(guān)：HPVl6型多見于宮頸鱗癌，HPVl8型以宮頸腺癌為主；流行病學(xué)上，HPV16 感染的盛行率高于HPV18感染，是導(dǎo)致宮頸癌最常見的類型[8]。因此臨床上子宮頸癌以鱗狀細(xì)胞癌表現(xiàn)為主，腺癌則相對少見。

定量蛋白質(zhì)組學(xué)是蛋白質(zhì)組研究的重要內(nèi)容，通過對基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)的定量分析，以了解基因在不同的生理、病理和逆境條件下的表達(dá)情況。非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)(label-free quantitative proteomics technology)的定量模型中，認(rèn)為肽段在質(zhì)譜中被捕獲檢測的頻率與其在混合物中的豐度成正相關(guān)，因此蛋白質(zhì)被質(zhì)譜檢測的計(jì)數(shù)反映了蛋白質(zhì)的豐度，通過適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)公式可以將質(zhì)譜檢測計(jì)數(shù)與蛋白質(zhì)的量聯(lián)系起來，從而對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量[9-10]。

目前，在蛋白質(zhì)組學(xué)的基礎(chǔ)上，有學(xué)者提出了分泌蛋白質(zhì)組(secretome)的概念[9，11]，血清分泌蛋白質(zhì)組學(xué)是指血清中的全部分泌蛋白質(zhì)，來源于各種組織或細(xì)胞的分泌或者泄漏，包括細(xì)胞因子、趨化因子、激素、消化酶、抗體、胞外蛋白酶和毒素等功能各異的蛋白，并與細(xì)胞的黏連、轉(zhuǎn)移、分化、增殖和免疫應(yīng)答等多種生物學(xué)進(jìn)程有關(guān)[12]。隨著血清分泌蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤中的發(fā)展，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一批與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)的新的血清蛋白質(zhì)標(biāo)志物[13-14]。

本研究通過Label Free方法 分 析宮頸癌細(xì)胞系分泌蛋白中共同分泌蛋白一共有729種，而特異性蛋白C33細(xì)胞有859種，Caski細(xì)胞有143種，Siha細(xì)胞有128種。對共同分泌蛋白以及特異性蛋白進(jìn)行提取分析進(jìn)行更深入研究，可為進(jìn)一步尋找可能的HPV相關(guān)腫瘤分子標(biāo)記物以及宮頸癌早期診斷提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)[9]。在共性蛋白中發(fā)現(xiàn)的4類較為集中的類型：①熱休克蛋白類(heat shock，HSPs)是在從細(xì)菌到哺乳動(dòng)物中廣泛存在的一類熱應(yīng)激蛋白質(zhì)，各種應(yīng)激刺激可誘導(dǎo)其快速高表達(dá)，具有維持細(xì)胞蛋白穩(wěn)定、對抗有害應(yīng)激、保護(hù)細(xì)胞生存等功能。研究發(fā)現(xiàn)，HSP70以及HSP90在宮頸癌組織中過度表達(dá)[15-17]，并且隨著惡性程度升高而表達(dá)數(shù)量增多，被認(rèn)為與宮頸癌的轉(zhuǎn)化與增殖密切相關(guān)[18]；②異質(zhì)性核糖核蛋白類(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，HNRP)是RNA 結(jié)合蛋白，與細(xì)胞核中的前mRNA相關(guān)，并且影響mRNA前體的加工和其他方面的mRNA代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)，具有不同的核酸結(jié)合特性。其中異質(zhì)性核糖核蛋白C被證實(shí)與HPV16感染進(jìn)程相關(guān)[19]，異質(zhì)性核糖核蛋白K被證實(shí)與鱗狀細(xì)胞癌感染相關(guān)[20]；③層黏連蛋白類(laminin，LN)是構(gòu)成細(xì)胞間質(zhì)的一種非膠原糖，在肝內(nèi)主要由內(nèi)皮細(xì)胞及貯脂細(xì)胞合成，與膠原一起構(gòu)成基底膜的成分。其生物功能是細(xì)胞黏著于基質(zhì)的介質(zhì)，并與多種基底膜成分結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化。研究表明lamini gama-1會(huì)增加子宮惡性腫瘤的嚴(yán)重程度及加速腫瘤發(fā)展[21]，是一種潛在的分子標(biāo)記物；④阿爾多酮還原酶(Aldoketo reductase family 1，AKR1)：將視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)化為視黃醇的還原酶。已經(jīng)在多種類型的腫瘤中如非小細(xì)胞肺癌中觀察到，并且?guī)缀醪怀霈F(xiàn)在正常的組織中。而根據(jù)研究顯示，其在宮頸癌手術(shù)后，含量和復(fù)發(fā)的可能性成正比，說明這種蛋白可能是宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的信號(hào)分子[22]。

同時(shí)，通過KEGG通路分析得到3種宮頸癌相關(guān)細(xì)胞蛋白是以溶酶體的代謝與內(nèi)吞作用為主要信號(hào)通路。有研究表明，HPV16是通過與細(xì)胞表面受體結(jié)合和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)發(fā)生作用后[23]，實(shí)質(zhì)上是通過巨胞飲作用利用一種潛在的新配體誘導(dǎo)的新型內(nèi)吞途徑[24]，并且不依賴網(wǎng)格蛋白細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷途徑進(jìn)人細(xì)內(nèi)的[23-25]。HPV16病毒進(jìn)入細(xì)胞后，依賴于肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)和酪氨酸激酶信號(hào)，攜帶到晚期內(nèi)涵體或溶酶體中，進(jìn)行緩慢的酸依賴性穿透，并通過暴露于低pH而活化[23]。這從側(cè)面證實(shí)說明HPV16入胞與活化和溶酶體與內(nèi)吞作用有關(guān)，溶酶體與其相關(guān)蛋白可以成為調(diào)節(jié)HPV16活化的關(guān)鍵。

本文通過運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)label free的方法，篩選分析了與HPV16相關(guān)的3類宮頸癌細(xì)胞系Siha、Caski、C33共性的分泌蛋白并聯(lián)系蛋白通路，為進(jìn)一步篩選宮頸癌血清蛋白標(biāo)志物以及尋求腫瘤治療方案奠定了基礎(chǔ)。