EGCG抑制HBV復(fù)制的分子機(jī)理研究

王平 劉國輝 詹森林 袁靜 吳其愷

518112深圳市第三人民醫(yī)院

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶中茶多酚的主要組成成分。在干的綠茶葉子中，EGCG的含量占據(jù)所有茶多酚的59%左右［1］。EGCG具有廣譜抗病毒作用，可有效抑制乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）、登革病毒（dengue virus，DENV）、基孔肯雅病毒（chikungunya virus，CHIKV）、寨卡病毒（zika virus，ZIKV）、EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）等多種病毒的復(fù)制［1］。 在抗 HBV方面，有研究報道，EGCG可阻止 HBV與其受體NTCP 結(jié)合［2］，并抑制 HBV DNA 復(fù)制、HBV RNA 和HBV cccDNA合成等多個過程［3-4］。然而，EGCG調(diào)控宿主細(xì)胞因子，進(jìn)而抑制HBV復(fù)制的分子機(jī)理卻鮮 有 報 道［5］。 HNFs（hepatocyte-enriched nuclear factors）是宿主肝細(xì)胞中調(diào)控基因表達(dá)的一類轉(zhuǎn)錄因子的總稱。有研究報道，在眾多的HNFs蛋白亞型中，HNF4α在HBV復(fù)制的細(xì)胞模型中表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)HBV的復(fù)制［6］?？紤]到EGCG可調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄［7-9］，此次研究了EGCG對HNF4α表達(dá)的影響以及HNF4α在EGCG介導(dǎo)的抗HBV信號通路中的作用。研究發(fā)現(xiàn)：（1）EGCG顯著下調(diào)HepG2.2.15細(xì)胞中HNF4α的表達(dá)；（2）在Hep.2.15細(xì)胞中，利用siRNA沉默HNF4α的表達(dá)，顯著降低HBV DNA的含量；（3）在 siRNA介導(dǎo)的 HNF4α沉默的細(xì)胞中，EGCG對HBV復(fù)制的抑制作用變?nèi)?。綜上所述，本研究提示，EGCG通過下調(diào)HNF4α的表達(dá)可能是其發(fā)揮抗HBV作用的一種重要途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 EGCG（CAS：989-51-5）購自百靈威科技公司；CCK-8檢測試劑盒（C0037）購自Beyotime公司；GAPDH 抗體 （＃5174）和 HNF4α 抗體（＃3113）購自 Cell Signaling Technology公司；特異沉默 HNF4α 編碼基因的 siRNA（siRNA ID：144546）和對照 siRNA（siRNA ID：142980）采購自 Thermo Fisher公司；引物購自上海生工；逆轉(zhuǎn)錄試劑和熒光定量PCR試劑購自TaKaRa公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素和鏈霉素、胰蛋白酶、Opti-MEM培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)染試劑 lipofectamine 2000購自Thermo Fisher公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購自康寧公司。

1.2 Hep G2.2.15細(xì)胞的培養(yǎng) HepG2.2.15細(xì)胞接種于DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM＋10% 胎牛血清＋1% 青霉素和鏈霉素）中，置于37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 EGCG處理Hep G2.2.15細(xì)胞 EGCG溶解于DMSO中，4℃ 避光保存。HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，去除細(xì)胞培養(yǎng)基，并用PBS洗兩遍。在細(xì)胞培養(yǎng)板中加入含有25μmol／L EGCG的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞備用。

1.4 基因沉默實驗 將HepG2.2.15細(xì)胞接種于不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基中（DMEM＋10%FBS）培養(yǎng)12 h，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞兩次后將細(xì)胞培養(yǎng)基換成Opti-MEM。每個12孔中Opti-MEM的體積為0.5 ml。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染時，每個孔的siRNA用量為80 pmol，lipofectamine 2 000的用量為1.5 μl。加入轉(zhuǎn)染試劑后，在37℃ 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，然后在每個孔中補(bǔ)加Opti-MEM，至終體積1 ml。繼續(xù)在37℃ 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)基，進(jìn)行下一步實驗。

1.5 HBV病毒顆粒的純化和檢測 HBV病毒顆粒的純化參照前人發(fā)表的文章［10］。根據(jù)HBV病毒顆粒在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外分布的不同，HBV DNA的提取步驟稍有不同。細(xì)胞培養(yǎng)基中HBV病毒顆粒的純化步驟如下：收集細(xì)胞培養(yǎng)基，2 000×g離心力的條件下，室溫離心2 min，去除細(xì)胞殘渣。在500 μl的細(xì)胞培養(yǎng)基中，加入等體積的沉淀劑（20%PEG 8000 ＋1.5 mol／L NaCl），4 ℃過夜沉淀，16 000×g離心30 min，所得沉淀即含有HBV顆粒。將HBV 顆粒重懸于緩沖液中（40 mmol／L Tris-HCl，pH 8.0，10 mmol／L MgSO4，1 mmol／L CaCl2），并加入DNase I（終濃度為2U），37℃水浴加熱30 min后，65℃加熱10 min。在上述溶液中加入10%體積的2%的 SDS和蛋白酶 K（終濃度為 0.5 mg／ml），55℃ 水浴加熱1 h后，用磁珠法純化HBV DNA（詳見天根磁珠純化試劑盒DP710說明書）。細(xì)胞中的HBV病毒顆粒的純化方法如下：細(xì)胞經(jīng)RIPA裂解液（碧云天）裂解后，于12 000×g離心力下離心30 min，取上清液200μl，加入等體積的沉淀劑沉淀。后續(xù)操作與培養(yǎng)基中HBV顆粒的純化方法相同。通過熒光定量PCR的方法檢測HBV DNA的含量。HBV特異性引物序列參照文獻(xiàn)［10］，具體序列如下： HBV-f（5’-AGTGTGGATTCGCACTCCT-3’），HBV-r（5’-GAGTTCTTCTTCTAGGGGACCTG-3’）。PCR反應(yīng)體系和方法參照TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明書。

1.6 RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄以及HNF4αmRNA水平檢測 本研究中，采用相對熒光定量PCR的方法，檢測 HNF4α在轉(zhuǎn)錄水平的相對含量。利用TRIZOL試劑提取細(xì)胞中的總 RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄（TaKaRa，RR047a）合成cDNA。熒光定量 PCR所用的引物序列參照文獻(xiàn)［6］，具體序列為：HNF4α-f（5’-CAGGACCCACCAGACACGTC-3’）， HNF4α-r（5’-TCGAGGCACCGTAGTGTTTG-3’）， GADPH-f（5’-GATTCCACCCATGGCAAATTCCA-3’）， GAP DH-r（5’-TGGTGATGGGATTTCCATTGAT GA-3’）。熒光定量PCR參照TaKaRa熒光定量PCR試劑（RR82LR）說明書進(jìn)行。

1.6 Western blot實驗 細(xì)胞經(jīng)RIPA裂解液裂解后，4℃，16 000×g離心30 min。利用12%的SDSPA GE膠分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用含有5%脫脂牛奶的PBS過夜封閉。一抗按照1∶1 000的比例稀釋，二抗按照1∶5 000的比例稀釋，經(jīng)過顯色、曝光、壓片步驟后，檢測 HNF4α、GAPDH的含量。

A：細(xì)胞活性實驗（CCK-8）；B：細(xì)胞內(nèi)HBV DNA相對含量（QPCR）；C：細(xì)胞外HBV DNA相對含量（QPCR）圖1 EGCG處理降低細(xì)胞內(nèi)外HBV DNA的含量A： Cell viability was analyzed by CCK-8 Kit； B and C： In vivo and in vitro HBV DNA level was tested by QPCRFig.1 EGCG treatment significantly decrease HBV DNA amount both in vivo and in vitro

2 結(jié)果

2.1 EGCG顯著抑制HBV復(fù)制 首先研究EGCG對HepG2.2.15細(xì)胞復(fù)制的影響。如圖1 A所示，與對照組（DMSO）相比，經(jīng)25μmol／L的 EGCG處理48 h后，細(xì)胞活力不受影響。實驗結(jié)果表明，25 μmol／L的 EGCG對 HepG2.2.15細(xì)胞沒有毒性。接下來研究EGCG對HBV復(fù)制的影響。如圖1B和1C所示，與對照組相比，EGCG處理HepG2.2.15細(xì)胞48 h后，細(xì)胞內(nèi)外HBV DNA的含量顯著下降，表明EGCG顯著抑制HBV復(fù)制。

2.2 EGCG顯著下調(diào)HepG2.2.15細(xì)胞中HNF4a的含量 研究表明，在HBV復(fù)制的肝細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄因子 HNF4α表達(dá)上調(diào)并促進(jìn) HBV DNA復(fù)制［6］?？紤]到EGCG可調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，且EGCG調(diào)控HNFs的研究尚未有報道，此次研究了EGCG對轉(zhuǎn)錄因子HNF4a的調(diào)控作用。如圖2 A和2B所示，分別利用熒光定量 PCR和 Western blot方法檢測了HepG2.2.15細(xì)胞中HNF4αmRNA和蛋白表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG處理顯著降低HNF4α的表達(dá)，表明EGCG處理可顯著下調(diào)宿主細(xì)胞中HNF4α的表達(dá)。

2.3 沉默HNF4a編碼基因的表達(dá)導(dǎo)致EGCG抗HBV作用減弱 進(jìn)一步研究了HNF4α在EGCG介導(dǎo)的抗HBV信號通路中的作用。利用siRNA沉默HNF4α的表達(dá)后，研究了HNF4a沉默表達(dá)對EGCG抗HBV作用的影響。如圖3 A和圖3B所示，沉默HNF4α的表達(dá)后，EGCG抗HBV復(fù)制作用顯著減弱，表明EGCG通過下調(diào)HNF4α的表達(dá)，抑制HBV復(fù)制。

A：利用熒光定量PCR方法檢測HNF4αmRNA相對含量；B：利用Western Blot檢測HNF4α的蛋白表達(dá)水平圖2 EGCG下調(diào)HepG2.2.15細(xì)胞中HNF4α的表達(dá)A：HNF4α mRNA expression was tested by QPCR；B：Western Blot was used to test HNF4α protein expressionFig.2 EGCG treatment down regulates HNF4αexpression in HepG2.2.15 cells

A：利用siRNA沉默HNF4a的表達(dá)；B：沉默HNF4α基因表達(dá)后，用熒光定量PCR方法檢測細(xì)胞內(nèi)外HBV顆粒中DNA的含量圖3 沉默HNF4a基因表達(dá)后EGCG抗HBV作用顯著減弱A： HNF4α knock down was tested by western blot；B：HBV titers level was tested by QPCRFig.3 EGCG mediated anti-HBV role decreased significantly upon HNF4a knock down

3 討論

作為綠茶中含量最多的茶多酚，EGCG具有廣譜抗病毒作用。EGCG抑制HBV DNA復(fù)制作用，此前已經(jīng)有大量文獻(xiàn)報道。比如，Xu等［4］以HepG2-N10為細(xì)胞模型，研究了EGCG的抗HBV作用。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG處理可顯著抑制HBV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄并降低HBsAg和HBeAg的含量。亦有研究者發(fā)現(xiàn)，低濃度的EGCG 可抑制 HBV mRNA轉(zhuǎn)錄［3］，阻止HBV顆粒進(jìn)入細(xì)胞［2］，或通過改變細(xì)胞微環(huán)境，阻止HBV復(fù)制［11］。然而，上述有關(guān)EGCG抗HBV作用的研究對象多集中病毒層面，很少涉及到EGCG對宿主細(xì)胞內(nèi)在因子的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A與HSC70相互作用，并招募HNF1α形成復(fù)合體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而調(diào)控HNF1α的表達(dá)和以及HCV的復(fù)制［12］。在這一過程中HNF1a是促進(jìn)HCV復(fù)制的關(guān)鍵細(xì)胞因子?？紤]到EGCG同時具有抗 HCV作用［13］，且在乙肝細(xì)胞模型中，HNF1α與HNF4α協(xié)同作用，此次研究了HNF4α在EGCG抗HBV信號通路中的作用。

HNF4α是HNFs家族成員中唯一的促進(jìn)HBV復(fù)制 的 轉(zhuǎn) 錄 因 子［6］。 Raney 等［14］研 究 發(fā) 現(xiàn)， 在HepG2.1細(xì)胞中過表達(dá)HNF4α，可使HBV preS1轉(zhuǎn)錄水平提高9倍。而Yu等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞HuH7中，過表達(dá)HNF4α則會增加pgRNA的表達(dá)至原來的14倍。這些研究顯示，HNF4α是細(xì)胞中重要的抗HBV因子。本研究利用HBV復(fù)制的細(xì)胞模型HepG2.2.15，研究了EGCG對HBV復(fù)制的影響。研究發(fā)現(xiàn) EGCG可下調(diào) HNF4α表達(dá)，并且抑制HBV DNA復(fù)制。利用siRNA沉默HNF4α的表達(dá)后，EGCG介導(dǎo)的抗 HBV作用幾乎消失，表明HNF4a是EGCG抗HBV信號通路中的重要細(xì)胞因子。 利用基因敲除實驗，Yu等［15］發(fā)現(xiàn)，HNF4α 可結(jié)合到HBV的基因組上，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)。其中HBV基因組上preS1和核心蛋白的兩個編碼區(qū)（nt1992-2435和 nt2830-3068）是 HNF4α的結(jié)合位點［16］。這一結(jié)果提示，EGCG介導(dǎo)的HNF4a的表達(dá)下調(diào)，可能會減少HNF4α與HBV基因組結(jié)合，進(jìn)而降低HBV基因的轉(zhuǎn)錄，相關(guān)實驗正在開展中。值得注意的是，EGCG在細(xì)胞中穩(wěn)定性是限制其成藥的一個重要的因素，因此科學(xué)工作者開發(fā)了大量的EGCG類似物以增加其穩(wěn)定性［1］。這些EGCG類似物是否具有更好的抗HBV作用，未來值得探索。另外，考慮到EGCG的毒副作用較小，我們擬在接下來的工作中探索EGCG和核苷類藥物聯(lián)合用藥的可能性。

利益沖突 無