引起某禽類養(yǎng)殖場疫情的H3N2亞型流感病毒全基因組進(jìn)化分析

徐春雪 劉偉 焦伯延 王震 劉倜 孫林 張欽鳳 王顯軍

271000泰安，泰山醫(yī)學(xué)院（徐春雪、張欽鳳）；272000濟寧市疾病預(yù)防控制中心（劉偉、焦伯延）；272100濟寧市兗州區(qū)疾病預(yù)防控制中心（王震）；250014濟南，山東省疾病預(yù)防控制中心山東大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)研究院山東省傳染病重點實驗室（徐春雪、劉倜、孫林、王顯軍）

H3N2流感病毒能引起季節(jié)性流行，抗原變異頻繁、傳染性強，經(jīng)常發(fā)生抗原漂移或抗原轉(zhuǎn)變，每隔2～3年在人群中流行一次，造成人群感染，甚至造成死亡［1］。在某些情況下季節(jié)性H3N2流感病毒能與其他種屬流感病毒發(fā)生基因重組，產(chǎn)生新的流感亞型，引起暴發(fā)、流行，甚至流感大流行。H3N2流感病毒不僅感染人，也能感染禽和豬并導(dǎo)致發(fā)?。?］。1998年在美國豬群中流行的H3N2豬流感病毒是人、豬和禽間的三源重組病毒［3］；2012年在美國人群中流行的H3N2豬流感變異株含有甲型H1N1流感病毒的M基因片段，至少導(dǎo)致400人感染［4］。H3N2流感病毒定期會有一定的流行，而疫苗株對已經(jīng)發(fā)生抗原突變的菌株不能產(chǎn)生有效的保護，因此對流行病毒株的分子變化進(jìn)行監(jiān)測至關(guān)重要。2015年9月監(jiān)測到山東省一禽類養(yǎng)殖場工人間發(fā)生1起流感樣病例（influenza-like illness，ILI）暴發(fā)疫情，為了解所致病原及其變異特點，本研究開展了流行病學(xué)調(diào)查、病毒分離、全基因測序和進(jìn)化分析。

1 材料與方法

1.1 病例定義 ILI定義：發(fā)熱（體溫≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一者。暴發(fā)疫情的定義：指同一地區(qū)或單位內(nèi)在較短時間內(nèi)出現(xiàn)異常增多的流感樣病例。

1.2 流行病學(xué)調(diào)查 2015年9月3日，山東省某市報告一起在禽類養(yǎng)殖場工人間的流感樣病例暴發(fā)疫情，現(xiàn)場調(diào)查包括對所有從業(yè)人員進(jìn)行登記、對病例進(jìn)行個案調(diào)查、對密切接觸者進(jìn)行醫(yī)學(xué)觀察、調(diào)查該禽類養(yǎng)殖場基本信息、養(yǎng)禽情況、人員流動情況、采集標(biāo)本等。暴發(fā)調(diào)查按照中國疾病預(yù)防控制中心《流感樣病例暴發(fā)疫情處置指南》［5］（2012年版）開展。

1.3 標(biāo)本采集及PCR檢測 規(guī)范采集所有ILI的咽拭子標(biāo)本，立即送實驗室提取標(biāo)本RNA（RNA提取試劑盒：Qiagen 74104），應(yīng)用熒光定量RT-PCR試劑盒（Qiagen 204443）開展流感病毒亞型鑒定檢測，包括甲型流感、乙型流感、甲型 H1N1流感病毒、H3N2流感病毒及禽流感H5、H7和 H9亞型。引物、探針按照中國疾病預(yù)防控制中心發(fā)布的《全國流感監(jiān)測技術(shù)指南》提供的序列在上海生工進(jìn)行合成，熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件均按照《全國流感監(jiān)測技術(shù)指南（2012版）》提供的方案進(jìn)行。

1.4 病毒培養(yǎng)及鑒定 在BSL-2級實驗室內(nèi)將處理好的核酸檢測陽性標(biāo)本0.5～1 ml，接種于75%～90%單層成片生長MDCK細(xì)胞，收集病毒液，用1% 人“O”型血紅細(xì)胞進(jìn)行血凝試驗（HA），檢測病毒的存在及滴度。HA≥8的病毒液做血凝抑制試驗（HI）測定滴度及用國家流感中心下發(fā)的流感鑒定試劑盒進(jìn)行分型鑒定；HA＜8的培養(yǎng)液繼續(xù)盲傳二代細(xì)胞培養(yǎng)。

提取分離到的流感病毒RNA，利用Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega A3500）反轉(zhuǎn)錄成cDNA后直接送至上海生工進(jìn)行二代全基因組測序。測序完成后對序列進(jìn)行拼接，運用EditSeq和MEGA5.05軟件對流感病毒基因核苷酸序列進(jìn)行比對和分析，核苷酸序列來源于GISAID及NCBI數(shù)據(jù)庫。采用MEGA5.0中自帶的Clustal W軟件進(jìn)行比對，采用鄰接法（Neighbour-Jioning）法構(gòu)建種系進(jìn)化樹，比較分析變異情況，Bootsrap檢驗重復(fù)值設(shè)為1 000。以WHO推薦的 2015—2016年流感疫苗株 A／Switzerland／9715293／2013（H3N2）［6］作為參考毒株。

2 結(jié)果

2.1 暴發(fā)點基本情況 發(fā)生暴發(fā)點的禽類養(yǎng)殖廠養(yǎng)殖單一品種肉食雞，約有種雞10萬只，采取封閉式管理。工作人員43人，多為外來打工人員，平時吃住在廠，近期無新從業(yè)人員招入，但幾乎每日有本場人員外出購買食材。廠內(nèi)消毒設(shè)施齊全、操作流程比較規(guī)范。

此次疫情涉及暴露人群43人，ILI病例15人，罹患率為34.88%；所有患者均出現(xiàn)發(fā)熱、咽痛，其中6例出現(xiàn)咳嗽，部分伴有乏力、肌肉酸痛等癥狀；發(fā)熱最高體溫在38～39℃的有8例，超過39℃的2人，其余在38℃以下。無重癥、死亡病例，無住院病例，未發(fā)現(xiàn)有合并癥患者。所有人員過去一年中均未接種流感疫苗，其中2人接觸過死禽。

表1 H3N2病毒基因氨基酸序列分析Tab.1 Analysis of amino acid sequences of H3N2 influenza virus

首發(fā)病例發(fā)生在2015年9月3日，其中發(fā)病病例數(shù)分布在3日2例、4日2例、5日7例、6日4例。男性9例，女性6例。

2.2 病原學(xué)檢測 采集15例ILI患者咽拭子標(biāo)本，采用熒光定量RT-PCR檢測，陽性11例，陽性率為73.3%；對11份陽性標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，分離到流感病毒5株，經(jīng)鑒定均為季節(jié)性A（H3N2）亞型流感病毒，分別命名為 A／shandong／yanzhou／34／2015（H3N2）； A／shandong／yanzhou／35／2015 （H3N2）；A／shandong／yanzhou／37／2015（H3N2）；A／shandong／yanzhou／38／2015（H3N2）；A／shandong／yanzhou／39／2015（H3N2）。

2.3 全基因組測序及基因進(jìn)化分析 對本次暴發(fā)分離到的5株流感病毒進(jìn)行了全基因組測序。

2.3.1 同源性分析：與疫苗株 A／Switzerland／9715293／2013（H3N2）相比，5 株 H3N2 流感病毒的8個基因片段的同源性為98.3% ～99.5%；與豬的H3N2 流 感 病 毒 A／swine／Korea／CY03-18／2012（H3N2）相比，8個基因片段的同源性為76.2% ～96.3%；與禽流感病毒 A／chicken／Shanghai／LPM2／2013（H3N2）相比，8個基因片段的同源性為66%～92.1%。除PB1外，其余7個基因片段與豬群和禽類的同源性均在90%以下。

2.3.2 H3N2亞型甲型流感病毒流行株基因進(jìn)化分析：通過HA、NA進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，本次暴發(fā)流行株均屬同一分支，與 2015—2016年度疫苗株 A／Switzerland／9715293／2013（H3N2）同屬一分支，差異性小，同源性近。同時利用流感病毒6個內(nèi)部基因構(gòu)建進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)山東暴發(fā)流行株6個內(nèi)部基因均屬同一分支，與 2015—2016年度疫苗株 A／Switzerland／9715293／2013同屬一分支，差異性小，同源性近；6個內(nèi)部基因與豬流感病毒和禽流感病毒的內(nèi)部基因差異較大，同源性較遠(yuǎn)，未見禽流感病毒與人季節(jié)性流感病毒基因重組。具體見圖1。

圖1 H3N2亞型毒株的8個基因片段進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of H3N2 influenza virus 8 genes

2.3.3 H3N2病毒基因核苷酸序列及氨基酸序列分析：與2015—2016疫苗株HA蛋白相比，本次暴發(fā)的5株H3N2流感病毒共有14個氨基酸位點發(fā)生了替換，變異率為（2.47%），丟失糖基化位點NSS160-162，同時發(fā)生了144（A-T）變異，新增糖基化位點NWT142-144；有8處變異發(fā)生在抗原決定簇區(qū)，其中S138 A、G142R、N144S位于A抗原決定簇，A128T、S159Y、K160T位于B抗原決定簇中，Q311H位于C抗原決定簇，N171 K位于D抗原決定簇，而且128、138處氨基酸位點變異與禽類相同。NA蛋白共有7個氨基酸位點發(fā)生了替換，變異率為（1.64%），新增糖基化位點 NRT151-153、NAT245-247。 未發(fā)現(xiàn) H274Y、R292 K、I222R／K／V 等神經(jīng)氨酸酶抑制劑耐藥突變，提示其對達(dá)菲類藥物敏感。對測定株的位于M基因的S31 N、V27 A等M2離子通道抑制劑耐藥位點進(jìn)行分析，全部毒株的第31位均為N，提示其對金剛烷胺類藥物耐藥。氨基酸推測顯示：PB2共2個氨基酸位點發(fā)生了替換，其中I588T位點氨基酸變異與禽類相同；PA共10個氨基酸位點發(fā)生了替換，有8處氨基酸變異與禽類相同；NS1共2個氨基酸位點發(fā)生了替換，其中I124 M位點氨基酸變異與禽類相同；NP共2個氨基酸位點發(fā)生了替換；PB1未發(fā)現(xiàn)氨基酸位點發(fā)生替換。具體見表1。

3 討論

本次禽類養(yǎng)殖場流感暴發(fā)疫情是由季節(jié)性A（H3N2）流感病毒引起，共報告流感樣病例15例，罹患率為34.88%，確診病例11例。所有病例均為上呼吸道癥狀，未出現(xiàn)并發(fā)癥，無死亡病例。

季節(jié)性A（H3N2）流感病毒自從1968年引起全球大流行以來，不斷發(fā)生變異和抗原轉(zhuǎn)變。雖然本次H3N2流感疫情范圍小，但從病毒HA蛋白的抗原決定簇來看，部分抗原決定簇的相關(guān)位點已經(jīng)發(fā)生變異，且以A抗原決定簇和B抗原決定簇最多，而A和B抗原決定簇在抗原轉(zhuǎn)變中發(fā)揮重要的作用［7］。研究發(fā)現(xiàn)HA1蛋白主要抗原決定區(qū)中142、144、159位點氨基酸發(fā)生 G142R，N144S，S159Y 突變，引起HA蛋白抗原性漂移，通常認(rèn)為HA1區(qū)蛋白分子上至少應(yīng)有4個以上的氨基酸發(fā)生了替換且這4個替換必須分布在2個以上抗原決定簇內(nèi)有可能形成具有流行病學(xué)意義的新變種［8］，本文研究發(fā)現(xiàn)A-D區(qū)決定簇均存在氨基酸位點變異，此突變病毒株可能引起此次暴發(fā)流行。流感病毒主要抗原決定區(qū)是由HA1的受體結(jié)合位點（receptor bindingsite，RBS）［9］邊側(cè)的 7 個氨基酸位點組成，其中HA1氨基酸144位點的變異可以引起流感病毒抗原性的改變，以逃避機體已產(chǎn)生的特異性免疫應(yīng)答保護作用［10］。本研究中觀察到的突變可能是至關(guān)重要的，并且與 Mo／H3N2 毒株［11］一樣，可能有助于改變H3N2的抗原性和毒力。NA能促使病毒從宿主細(xì)胞表面釋放并進(jìn)一步向周圍細(xì)胞擴散，同時也是奧司他韋和扎那米韋2種神經(jīng)氨酸酶抑制劑藥物作用的靶點［12］，從NA蛋白來看，5株病毒均沒有發(fā)生H274Y的突變，說明均對神經(jīng)氨酸酶抑制劑敏感。M2蛋白僅存在于甲型流感病毒中，為抗流感藥物金剛烷胺和甲基烷胺的靶蛋白［13］，對5株病毒的M蛋白的第27位和31位進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)均為M2離子通道抑制劑耐藥位點，提示其對金剛烷胺類藥物耐藥。流感病毒聚合酶是由3個蛋白PA、PB2、NS所構(gòu)成的異源三聚體，PA與PB2蛋白有多個氨基酸序列發(fā)生了變異，其中絕大多數(shù)變異與禽類的氨基酸位點相同，由于PA、PB1、PB2在流感病毒各基因組中較為保守，因而其氨基酸序列的突變可能會從側(cè)面提供病毒進(jìn)化的相關(guān)依據(jù)［13］。

之前多項研究報道［14-17］，禽類養(yǎng)殖是禽流感或豬流感病毒突破種屬限制感染人的危險因素，可在一定程度上發(fā)生重組，并導(dǎo)致病毒的毒力和致病力增強，2012年在美國豬群中流行的H3N2流感病毒變異株在人群中引起暴發(fā)流行就是一個典型的案例［4］。 2015 年 Ma 等［18］研究者在美國的豬群中發(fā)現(xiàn)至少有10種不同基因型的新型重組H3N2流感病毒，并均與2009年甲型H1N1流感病毒發(fā)生重組，其中有3種重組H3N2流感病毒被證實在豬中是致病的和可傳播給人。 Raj?o等［19］發(fā)現(xiàn)豬 H3N2型流感病毒的血凝素（HA）基因與人季節(jié)性 A（H3N2）流感病毒的HA基因類似，且其內(nèi)部基因與甲型H1N1流感病毒的內(nèi)部基因相似，表明豬群作為流感病毒的“混合器”，在人或動物中不斷發(fā)生著重組。相關(guān)研究［20］表明中國東部的活禽市場曾發(fā)現(xiàn)H3N2禽流感病毒，同時2015年山東省發(fā)現(xiàn)了H3N2禽流感病毒（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。雖然此次疫情確定了季節(jié)性H3N2流感病毒為本次疫情的病原體，但對于禽類職業(yè)人群發(fā)生流感樣病例暴發(fā)疫情，仍然需要引起警惕。針對此次疫情，本研究仍有不足，未對2只病死禽及養(yǎng)殖場的禽類開展調(diào)查和標(biāo)本采集，但對病毒分離陽性毒株作了全基因組測序來確定疫情性質(zhì)，一定程度上彌補了現(xiàn)場資料信息不足的缺憾，為今后發(fā)生類似暴發(fā)疫情且禽類具體信息不全時的確定疫情性質(zhì)提供了新思路。

與季節(jié)性H1N1流感病毒相比，H3N2流感病毒進(jìn)化速度更快，更容易發(fā)生變異、重配，傳播更迅速廣泛［21］，流感病毒的感染率高［22］，本次暴發(fā)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該禽類養(yǎng)殖場的所有工作人員均無流感疫苗接種史，開展禽類養(yǎng)殖場、養(yǎng)豬場等從事與動物流感相關(guān)職業(yè)的全部人群流感疫苗接種工作、加強職業(yè)暴露人群對季節(jié)性流感、動物流感的防制知識宣傳，也能降低季節(jié)性流感病毒與禽流感病毒、豬流感病毒重配的機率。

利益沖突無