恒溫擴增熒光檢測技術(shù)在基層結(jié)核病實驗室的應(yīng)用價值

馬曉光 鄭丹薇 朱巖昆 石潔 王少華 李輝

結(jié)核病發(fā)病率及發(fā)布例數(shù)一直居于我國法定報告乙類傳染病的前列；肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌引起的肺部慢性傳染性疾病，嚴重危害人類的身體健康[1-3]。結(jié)核病的病原學(xué)檢測是結(jié)核病確診和治療的主要依據(jù)，也是發(fā)現(xiàn)傳染源的主要途徑。目前，我國肺結(jié)核的實驗室檢測主要依靠痰涂片(染色鏡檢)和痰培養(yǎng)。然而，傳統(tǒng)的痰涂片檢測敏感度低，且無法區(qū)分結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群與非結(jié)核分枝桿菌[4]，而痰培養(yǎng)方法雖有較高的敏感度和特異度，但檢測周期長、易發(fā)生污染，無法滿足臨床檢測的實際需要。因此，尋求簡便快速、敏感度高、特異度強的檢測方法成為臨床結(jié)核病診斷的當(dāng)務(wù)之急。本研究采用恒溫擴增熒光檢測技術(shù)，對4276例疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本分別進行痰涂片、痰培養(yǎng)和恒溫擴增熒光檢測。以痰培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)，對比分析痰涂片和恒溫核酸擴增熒光檢測技術(shù)的敏感度、特異度及檢測時間，評價恒溫擴增熒光檢測技術(shù)在基層結(jié)核病實驗室中的應(yīng)用價值。

材料和方法

一、研究對象

由于鄧州市結(jié)核病防治所、永城市結(jié)核病防治所、中牟縣衛(wèi)生防疫站、新密市疾病預(yù)防控制中心等4個縣級單位近年來一直參與結(jié)核病耐藥性監(jiān)測和“十二五”國家科技重大專項的研究，患者資料保存完整和實驗室診斷技術(shù)完善，因此選取這4個項目點進行采樣調(diào)查。2014年10月1日至2015年9月30日期間，4個項目單位共計納入疑似結(jié)核病患者4336例，按照《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》[5]中的要求收集痰標(biāo)本，每例患者收集3份痰標(biāo)本(即時痰、夜間痰、晨痰)，涂片后將3份痰標(biāo)本混合后進行痰培養(yǎng)和恒溫擴增熒光檢測。剔除污染、信息不全、無臨床診斷結(jié)果等患者，共納入4276例患者的痰標(biāo)本。

二、痰涂片抗酸染色顯微鏡檢查

按照《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》[5]中的要求對收集的患者痰標(biāo)本進行痰涂片、染色和顯微鏡檢操作；萋-尼染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

三、痰標(biāo)本培養(yǎng)

采用簡單法進行痰標(biāo)本的培養(yǎng)。將患者痰液用4%氫氧化鈉消化后，振蕩處理并靜置15 min后，用無菌一次性吸管接種于改良酸性羅氏培養(yǎng)基上。于37 ℃條件下進行培養(yǎng)，第3天和第7天各觀察1次，此后每周觀察一次并記錄生長過程，培養(yǎng)至菌落生長或8周后報告無菌落生長。采用噻吩-2羧酸肼(TCH)和對硝基苯甲酸(PNB)生長試驗進行菌種鑒定[6]。對生長菌落進行萋-尼染色，確認是否為抗酸桿菌。改良酸性羅氏培養(yǎng)基購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

四、恒溫擴增熒光檢測

痰培養(yǎng)剩余痰液吸取1 ml至帶蓋離心管中，12 000×g離心5 min，去上清；加生理鹽水1 ml，混勻，12 000×g離心5 min，去上清；加入100 μl DNA提取液，渦旋混勻15 s，煮沸10 min；12 000×g離心2 min，將制備好的DNA轉(zhuǎn)移至新的離心管中備用。按照n+2(n個待檢樣本+陰性對照+陽性對照)配制擴增液，每管23 μl分裝至PCR管中，將上述含有混勻試劑的PCR管中加入20 μl的密封液，隨后在密封液面以下加入2 μl制備好的DNA及陰性對照和陽性對照，3000×g離心30 s；63 ℃反應(yīng)45 min，由儀器自動判讀結(jié)果。恒溫擴增熒光檢測儀、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑盒等購自廣州迪澳生物技術(shù)有限公司。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

計數(shù)資料采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。以痰培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)，計算恒溫擴增熒光檢測技術(shù)、痰涂片的敏感度和特異度，使用Kappa檢驗評估痰涂片、恒溫擴增熒光檢測技術(shù)與痰培養(yǎng)的一致率。

六、倫理學(xué)審查

本研究由河南省疾病預(yù)防控制中心倫理委員會審核批準(zhǔn)。參與此次研究的患者均簽署知情同意書，并且整個研究階段均遵循倫理原則。

結(jié) 果

一、總體檢測結(jié)果

痰涂片檢出陽性者351例，陽性檢出率為8.21%(351/4276)；痰培養(yǎng)檢出陽性者576例，陽性檢出率為13.47%(576/4276)；恒溫擴增熒光檢測技術(shù)檢出陽性者733例，陽性檢出率為17.14%(733/4276)；以上3種檢測技術(shù)的陽性檢出率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=153.412，P<0.001)。痰培養(yǎng)陽性中有34例恒溫擴增熒光檢測技術(shù)檢測為陰性，采用噻吩-2羧酸肼(TCH)和對硝基苯甲酸(PNB)生長試驗進行菌種鑒定，按照《分枝桿菌痰培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》的標(biāo)準(zhǔn)[6]，鑒定為非結(jié)核分枝桿菌(NTM)。痰培養(yǎng)陰性中有233例恒溫擴增熒光檢測陽性，進行免疫學(xué)菌種鑒定(MPT64)且與臨床診斷復(fù)核后，確診為肺結(jié)核165例，肺部感染、肺炎等68例。

以痰培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)，痰涂片檢測的敏感度為57.29%(330/576)，95%的可信區(qū)間為53.12%～61.35%；特異度為99.43%(3645/3666)，95%的可信區(qū)間為99.10%～99.63%；陽性預(yù)測值為94.02%(330/351)，陰性預(yù)測值為93.68%(3645/3891)；一致率為93.70%，Kappa值為0.679。 恒溫擴增熒光檢測技術(shù)法的敏感度為86.81%(500/576)，95%的可信區(qū)間為83.70%～89.40%；特異度為93.64%(3433/3666)，95%的可信區(qū)間為92.79%～94.40%；陽性預(yù)測值為68.21%(500/733)，陰性預(yù)測值為97.83%(3433/3509)；一致率為92.71%，Kappa值為0.722(表1)。痰涂片與恒溫擴增熒光檢測技術(shù)檢測痰標(biāo)本的敏感度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=153.336，P<0.001)。

表1 痰涂片、恒溫擴增熒光檢測技術(shù)

注以痰培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)，分別計算痰涂片、恒溫擴增熒光檢測技術(shù)的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值。計算公式如下：敏感度=真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陰性數(shù))×100%；特異度=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陽性數(shù))×100%；一致率=(真陽性數(shù)+真陰性數(shù))/(真陽性數(shù)+假陰性數(shù)+真陰性數(shù)+假陽性數(shù))×100%，陽性預(yù)測值=真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陽性數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陰性數(shù))×100%

二、各縣級結(jié)核病防治機構(gòu)(簡稱“結(jié)防機構(gòu)”)檢測結(jié)果分析

對各個縣結(jié)防機構(gòu)采用恒溫擴增熒光檢測技術(shù)的檢測陽性率進行比較，鄧州市結(jié)核病防治所該方法檢測陽性率為28.14%；永城市結(jié)核病防治所該方法檢測陽性率為13.71%；中牟縣衛(wèi)生防疫站該方法檢測陽性率為14.36%；新密市疾病預(yù)防控制中心該方法檢測陽性率為12.26%。從表2可以看出，4個項目點對3種檢測方法的陽性檢出率比較，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，其中鄧州市結(jié)核病防治所3種方法的陽性檢出率均高于其他3個項目點，表明該項目點實驗室檢測能力相對較強。

三、檢測完成時間的比較

痰涂片每份樣本一般檢出時間需要2 h，但檢出率低，從我省數(shù)據(jù)顯示不到13%。雖然痰培養(yǎng)與痰涂片比較可明顯提高陽性檢出率，但每份樣本出報告的時間較長，需要將近2個月。恒溫擴增熒光檢測技術(shù)不僅與痰培養(yǎng)相比較具有較高的陽性檢出率，而且檢測時間較短，和痰涂片檢測時間相近，每份樣本檢測的完成時間大約為2 h，且可以直接鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，因此在檢測時間上與傳統(tǒng)痰涂片和痰培養(yǎng)相比有較大的優(yōu)勢。

表2 各縣級結(jié)核病防治機構(gòu)采用3種方法的陽性檢出率比較

討 論

結(jié)核病仍是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，全球約有1/3的人口是結(jié)核分枝桿菌感染者，且大多集中在發(fā)展中國家；結(jié)核病是成年人單一感染源致死的主要原因[6]。傳統(tǒng)結(jié)核病診斷方法有痰涂片、痰培養(yǎng)。痰涂片操作簡單、快捷，但對于含菌量較少的標(biāo)本容易漏檢；痰培養(yǎng)為檢測分枝桿菌的標(biāo)準(zhǔn)，陽性檢出率高于痰涂片法，但耗時較長，需2～8周才能報告結(jié)果，且痰涂片與痰培養(yǎng)均不能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和非結(jié)核分枝桿菌。

為了準(zhǔn)確、快速地檢測結(jié)核分枝桿菌，開展分子生物學(xué)檢測已成為發(fā)展趨勢。比如基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的檢測、基于分子膜雜交技術(shù)的檢測，以及基于基因芯片技術(shù)的檢測等[7-8]，但這些技術(shù)需要較高的專業(yè)知識和復(fù)雜的操作技術(shù)，并不適合于基層實驗室的使用。恒溫擴增技術(shù)是近年來迅速發(fā)展的一種檢測手段，由于具有操作簡單、檢測快速、結(jié)果準(zhǔn)確，以及擴增效率高于普通PCR、檢測成本低廉等優(yōu)勢，受到了越來越多的關(guān)注。并且恒溫擴增技術(shù)的反應(yīng)條件與其他常規(guī)的核酸擴增方法相比，要求比較簡單[9]。因為參與反應(yīng)的嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bst)DNA聚合酶在較寬泛的pH值和溫度范圍內(nèi)，均能保持較好的生物活性，且其對DNA模板的純度要求較低。所以恒溫擴增技術(shù)的整個反應(yīng)體系具有更好的耐受度。近年來，已有研究者應(yīng)用恒溫擴增技術(shù)檢測方法對結(jié)核病患者的臨床標(biāo)本進行快速診斷和評估[9-10]。

本研究使用恒溫擴增熒光檢測是將恒溫擴增與實時熒光技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)了結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的快速核酸擴增和自動化結(jié)果報告。該方法作為一種全新的體外快速診斷技術(shù)，通過Bst DNA聚合酶及結(jié)核特異性核酸片段的特異性引物，在恒溫條件下對樣本中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的核酸片段進行特異性擴增，擴增產(chǎn)物(DNA)與核酸染料結(jié)合后發(fā)出熒光信號，通過實時讀取熒光信號，根據(jù)擴增曲線判讀檢測結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，該方法對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群檢測的敏感度為86.81%，特異度為93.64%，并且該方法與痰培養(yǎng)檢測結(jié)果的Kappa值為0.722，說明其與痰培養(yǎng)結(jié)果比較具有非常好的一致性。同時4個項目點的數(shù)據(jù)顯示恒溫擴增熒光檢測與痰涂片和培養(yǎng)相比，明顯提高了陽性檢出率。由于該方法具有較好的敏感度和特異度，并且操作簡單、生物安全性高、檢測過程不易受干擾，因此可在基層實驗室作為快速檢測技術(shù)用于結(jié)核病的診斷。