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    重慶地區(qū)耐多藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥的相關(guān)基因特征分析

    2018-10-15 05:24:00胡彥劉潔沈靜朱大冕馮鑫陳林詹建歐喜超周楊趙雁林
    中國(guó)防癆雜志 2018年10期
    關(guān)鍵詞:重慶地區(qū)喹諾酮基因突變

    胡彥 劉潔 沈靜 朱大冕 馮鑫 陳林 詹建 歐喜超 周楊 趙雁林

    耐藥結(jié)核病尤其是耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)是全球及我國(guó)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。我國(guó)是全球30個(gè) MDR-TB高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一,2016年估算我國(guó)新發(fā)結(jié)核病患者89.5萬例,耐多藥/利福平耐藥結(jié)核病(MDR/RR-TB)患者7.3萬例,新患者和復(fù)治患者中MDR/RR-TB的發(fā)生率分別為7.1%和24%[1]。重慶是中國(guó)西部唯一的直轄市,轄39個(gè)區(qū)(縣),地區(qū)間發(fā)展不平衡,是結(jié)核病和耐藥結(jié)核病的高發(fā)區(qū),MDR-TB發(fā)生率為23.0%[2-3]。重慶地區(qū)結(jié)核病耐藥疫情形勢(shì)嚴(yán)峻。

    在MDR-TB的治療中,二線氟喹諾酮類(FQs)藥物尤為重要,是組成MDR-TB治療方案的核心藥物。但隨著FQs藥物在抗感染及結(jié)核病治療中的廣泛及不當(dāng)應(yīng)用,其耐藥率不斷增加。 筆者前期報(bào)道了重慶地區(qū)MDR-TB菌株氧氟沙星(Ofx)耐藥率為42.3%[3],但對(duì)新一代的FQs耐藥性報(bào)告尚少見。北京基因型菌株是中國(guó)的主要流行株[4],和其他基因型比較,由于北京基因型和耐藥性之間的高度關(guān)聯(lián),其在耐藥結(jié)核病的傳播中起著重要作用[5]。Parwati 等[6]報(bào)告北京基因型菌株有更高的藥物耐藥相關(guān)基因的突變頻率,因此,本研究通過采用最低抑菌濃度(MIC)法對(duì)重慶地區(qū)新一代FQs藥物進(jìn)行耐藥性檢測(cè),并對(duì)不同基因型的耐藥突變位點(diǎn)進(jìn)行分析,為重慶地區(qū)合理使用FQs藥物進(jìn)行MDR-TB治療提供依據(jù)。

    資料和方法

    一、一般資料

    收集2015年1月至2017年6月重慶市39個(gè)區(qū)(縣)結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)報(bào)告的967例MDR-TB可疑患者,均痰涂片抗酸桿菌陽性。967例患者的臨床分離株經(jīng)菌種鑒定及比例法藥敏試驗(yàn),確定為MDR-TB菌株229株(23.7%),分離自229例MDR-TB患者。其中,男173例,女56例;年齡17~79歲,平均(45.0士15.9)歲;初治患者84例,復(fù)治患者145例。

    二、實(shí)驗(yàn)方法

    1. 主要儀器和試劑:PCR儀為美國(guó)Bio-Rad CFX96 熒光定量PCR儀,Middle brook 7H9培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司(批號(hào):5173939),Alamar blue顯色液購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司(批號(hào):160905),氧氟沙星(Ofx)、左氧氟沙星(Lfx)、莫西沙星(Mfx)和加替沙星(Gfx)藥粉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,批號(hào)分別為:SLBG3234V、BCBK5832V、SZBE216XV和SLBG5170V。

    2. MIC檢測(cè):使用7H9液體培養(yǎng)基(7H9∶OADC=9∶1),通過微孔板Alamar blue顯色法測(cè)定FQs藥物的MIC值。本研究FQs藥物包括:Ofx、Lfx、Mfx、Gfx。MIC濃度梯度設(shè)置:0.031、0.063、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μg/ml。刮取改良L-J(Lowenstein-Jenden)培養(yǎng)基上肉眼可見后1至2周的新鮮菌落,進(jìn)行磨菌、比濁,制備1個(gè)麥?zhǔn)?McFarland)單位濃度的菌懸液,50倍稀釋后取100 μl接種到不同濃度梯度的7H9液體培養(yǎng)基中。37 ℃培養(yǎng)7 d后,加入70 μl顯色劑(Alamar blue∶5% Tween 80=2∶5),24 h后觀察顏色變化判斷MIC讀數(shù)。MIC界定標(biāo)準(zhǔn):藍(lán)色完全沒有發(fā)生改變的為最小藥物濃度。耐藥臨界濃度參照文獻(xiàn)[7-8]設(shè)置,Ofx、Mfx為2.0 μg/ml。Lfx、Gfx為0.5 μg/ml。

    3. DNA提?。喝∵m量經(jīng)改良L-J培養(yǎng)基培養(yǎng),生長(zhǎng)良好的菌落置于生理鹽水中,85 ℃孵育30 min滅活,離心收集菌體,用400 μl TE緩沖液懸菌,于95 ℃金屬浴60 min,16 200×g離心3 min,吸取上清液即作為DNA模板。

    4. 耐藥基因PCR-測(cè)序:針對(duì)喹諾酮耐藥決定區(qū)(quinolone resistance-determining region,QRDR)設(shè)計(jì)PCR及測(cè)序引物,引物序列參照文獻(xiàn)[3],由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為50 μl,包括2×Taq PCR Master Mix 25 μl、引物各1 μl,模板3 μl,去離子水20 μl。PCR 擴(kuò)增條件:94 ℃ 變性5 min;94 ℃,1 min,58 ℃退火1 min,72 ℃,1 min,35個(gè)循環(huán);再72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送北京擎科公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過在線比對(duì)軟件http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/Blast.與標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的耐藥相關(guān)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。

    5. 實(shí)時(shí)熒光PCR-熔解曲線基因分型:參照文獻(xiàn)[9-12],Rv2952基因用于鑒定北京與非北京基因型,mutT2基因用于北京基因型古代與現(xiàn)代型的鑒定。 采用10 μl反應(yīng)體系:10×反應(yīng)緩沖液1 μl、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP) 0.4 μl、上游引物0.05 μl(0.02 μmol/L)、下游引物1 μl(0.4 μmol/L)、探針0.2 μl(0.2 μmol/L)、酶 0.2 μl、DNA 0.5 μl、雙蒸水6.65 μl。反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 2 min; 變性95 ℃ 10 s,退火58 ℃ 10 s,延伸72 ℃ 10 s,共40個(gè)循環(huán),最終延伸72 ℃ 5 min。熔解曲線分析條件為:95 ℃變性5 min,40~80 ℃熔解曲線分析,每升高1 ℃采集1次熒光,檢測(cè)FAM和ROX 2個(gè)通道。引物和探針序列由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成,見表1。

    二、 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 19.0軟件,兩個(gè)或多個(gè)獨(dú)立樣本率的比較用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法(樣本量<40或理論頻數(shù)<1時(shí)),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、MDR-TB菌株FQs體外MIC結(jié)果

    229株MDR菌株中,94株(41.0%,94/229)對(duì)任一FQs藥物耐藥,耐Lfx、Mfx、Gfx者均同時(shí)耐Ofx。Ofx耐藥率最高,為41.0%(94/229),Lfx、Mfx耐藥率居中,分別為31.4%(72/229)、30.6%(70/229),Gfx耐藥率最低,為20.1%(46/229)。復(fù)治患者的4種FQs藥物耐藥率均高于初治患者,但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),229株MDR菌株中Ofx耐藥率明顯高于Lfx(χ2=4.573,P=0.032)、Mfx(χ2=5.471,P=0.019)、Gfx(χ2=23.702,P=0.000);Lfx、Mfx的耐藥率明顯高于Gfx(χ2=7.717,P=0.005;χ2=6.650,P=0.010)(表2)。

    二、FQs耐藥相關(guān)基因分子特征與MIC分布

    94株氟喹諾酮類耐藥表型菌株中,81株發(fā)生gyrA基因突變,突變率為86.2%(81/94),涉及6個(gè)密碼子,共9種突變類型,分布在74、88、89、90、91和 94位點(diǎn),94位突變頻率最高,為60.6%(57/94)。其中有7株為gyrA基因雙位點(diǎn)突變,顯示為高水平耐藥(Ofx、Lfx≥16 μg/ml,Mfx、Gfx≥4 μg/ml),1株顯示為Gfx中等水平耐藥(Gfx: 2 μg/ml)。gyrA基因單位點(diǎn)突變主要類型為Asp94Gly(30株)、Ala90Val(16株)、Asp94Asn(7株),其中,Ala90Val顯示為中低水平耐藥(Ofx、Lfx≤8 μg/ml,Mfx、Gfx≤2 μg/ml)。在135株氟喹諾酮敏感的MDR菌株中,有10株(7.4%,10/135)發(fā)生gyrA基因突變(表3)。

    與gyrA基因相比,gyrB基因較少發(fā)生突變。94株氟喹諾酮耐藥株中,10株(10.6%)發(fā)生了gyrB基因突變。1株為單一突變,突變類型為Gly512Arg。9株發(fā)生了gyrA與gyrB基因的聯(lián)合突變,其中Asp94Gly+Ala504Thr、Asp94Gly+Ala504Val顯示為高水平耐藥(表3)。

    表1 基因分型 PCR引物及探針序列

    表2 MDR-TB菌株對(duì)4種氟喹諾酮類藥物的藥物敏感性結(jié)果

    注初治患者中,a:與Lfx比較,χ2=1.380,P=0.240;b:與Mfx比較,χ2=1.380,P=0.240;c:與Gfx比較,χ2=6.035,P=0.014;d:與Mfx比較,χ2=0.000,P=1.000;e:與Gfx比較,χ2=1.698,P=0.193;f:與Gfx比較,χ2=1.698,P=0.193。復(fù)治患者中,g:與Lfx比較,χ2=3.242,P=0.072;h:與Mfx比較,χ2=4.190,P=0.041;i:與Gfx比較,χ2=18.000,P=0.000;j:與Mfx比較,χ2=0.062,P=0.804;k:與Gfx比較,χ2=6.184,P=0.013;l:與Gfx比較,χ2=5.028,P=0.025

    表3 MDR-TB 菌株gyrA、gyrB基因分子特征與最低抑菌濃度分布

    注a:至少1種氟喹諾酮類藥物耐藥;b:4種氟喹諾酮類藥物均敏感

    三、基因分型

    229株MDR菌株中,非北京基因型菌株39株(17.0%,39/229),北京基因型菌株190株(83.0%,190/229)。北京基因型中,古代型79株(41.6%,79/190),現(xiàn)代型111株(58.4%,111/190)。在94株FQs耐藥株中,非北京基因型菌株14株(14.9%,14/94),北京基因型菌株80株(85.1%,80/94)。北京基因型中,古代型32株(40.0%,32/80),現(xiàn)代型48株(60.0%,48/80)。

    四、耐藥基因在不同基因型間的突變情況

    94株氟喹諾酮耐藥株中,gyrA、gyrB基因突變?cè)诒本┡c非北京基因型菌株間的分布見表4。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),gyrB基因突變率在非北京基因型、北京基因型古代型與現(xiàn)代型之間分別為2/14(14.3%)、8/32(25.0%)和0/48(0.0%),現(xiàn)代北京型的gyrB基因突變率明顯低于古代北京型(χ2=10.700,P=0.001)和非北京型(Fisher確切檢驗(yàn),P=0.048)。

    討 論

    在MDR-TB的治療中,氟喹諾酮類藥物尤為重要,是組成MDR-TB治療方案的核心藥物之一。本研究發(fā)現(xiàn),重慶地區(qū)MDR-TB 菌株任一FQs藥物的耐藥率為41.0%,接近巴基斯坦的47%[13],但遠(yuǎn)高于WHO報(bào)告的全球MDR-TB/RR-TB患者中對(duì)任一FQs的耐藥率20.0%[1]及我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)的28.6%[14],說明重慶地區(qū)對(duì)FQs的耐藥情況較為嚴(yán)重。初治患者4種FQs藥物的耐藥率雖均低于復(fù)治患者,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明重慶地區(qū)FQs藥物原始耐藥情況并不樂觀,可能是因?yàn)榻陙鞦Qs藥物在臨床上作為廣譜抗生素被廣泛應(yīng)用于抗感染治療,不規(guī)范使用增加了其耐藥性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),初治患者的Ofx耐藥率與Lfx、Mfx差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但顯著高于Gfx,可能與在一般抗感染治療中,重慶地區(qū)相對(duì)較少使用Gfx有關(guān)。在復(fù)治患者中,對(duì)Ofx的耐藥率與Lfx的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但明顯高于Mfx;對(duì)Gfx的耐藥率均明顯低于Ofx、Lfx、Mfx,可能與先前重慶地區(qū)較為普遍地使用Ofx、Lfx治療耐藥結(jié)核病有關(guān)。

    表4 94株氟喹諾酮耐藥株gyrA和gyrB基因在北京與非北京基因型間的突變情況

    注表中括號(hào)外數(shù)值為“菌株數(shù)”,括號(hào)內(nèi)數(shù)值為“比率(%)”;表中“-”表示不適用該統(tǒng)計(jì)方法

    FQs藥物主要作用于細(xì)菌的 DNA 旋轉(zhuǎn)酶,使細(xì)菌 DNA 復(fù)制受阻,從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。DNA旋轉(zhuǎn)酶是由2個(gè) A亞單位(GyrA)和2個(gè) B 亞單位(GyrB)組成的四聚體,分別由gyrA和gyrB基因編碼[15-16]。由于不同地區(qū)結(jié)核病的流行病學(xué)、研究人群、二線抗結(jié)核藥物的使用情況等不同,各國(guó)家和地區(qū)所發(fā)現(xiàn)的gyrA、gyrB基因突變位點(diǎn)及頻率尚存在差異。本研究MDR結(jié)核分枝桿菌FQs耐藥株gyrA基因突變率為86.2%,高于我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)的72.4%[17]、江西的82.1%[18],低于華東地區(qū)的89.5%[19]。本研究中的突變位點(diǎn)包括74、88、89、90、91和94位密碼子,其中以94位密碼子突變最常見,占60.6%(57/94),與華東地區(qū)、江西省報(bào)道的最常見突變位點(diǎn)一致,分別是56.8%和69.2%[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)了7株gyrA基因雙位點(diǎn)突變,與高水平耐藥相關(guān)(Ofx、Lfx≥16 μg/ml,Mfx、Gfx≥4 μg/ml)。gyrB基因發(fā)生突變的比例較小。94株FQs耐藥株中,10株(10.6%)發(fā)生了gyrB突變,高于江西的5.1%[18],低于我國(guó)華東地區(qū)的11.6%和臺(tái)灣地區(qū)的31.0%[17,19]。9株為gyrA與gyrB基因聯(lián)合突變,其中Asp94Gly+Ala504Thr、Asp94Gly+Ala504Val顯示為高水平耐藥。

    94株FQs耐藥株中有12株未發(fā)現(xiàn)gyrA或(和)gyrB基因突變,提示其他耐藥機(jī)制的存在,如gyrA/gyrB基因QRDR以外區(qū)域的突變、細(xì)胞壁滲透性降低和藥物外排泵等。關(guān)于10株gyrA基因突變及6株gyrB基因突變但對(duì)FQs不耐藥的菌株,其MIC水平多處于關(guān)鍵濃度值及其以下2個(gè)濃度,可能存在藥敏試驗(yàn)結(jié)果判讀誤差或其他引起不準(zhǔn)確的因素。

    重慶地區(qū)MDR-TB菌株中,北京基因型菌株占83.0%,為本地區(qū)主要的流行菌株,且以現(xiàn)代型為主,與來自全國(guó)及部分省的數(shù)據(jù)一致[20-22]。在FQs耐藥株中,現(xiàn)代北京型的gyrB基因突變率明顯低于古代北京型和非北京型,提示現(xiàn)代北京基因型菌株可能相對(duì)不易發(fā)生gyrB基因突變,由于本地現(xiàn)代北京基因型菌株占多數(shù),所以由gyrB基因突變可能導(dǎo)致的耐藥在本地FQs耐藥中并不起主要作用。

    總之,本研究表明重慶地區(qū)MDR結(jié)核分枝桿菌對(duì)FQs藥物耐藥的情況不容樂觀,新一代FQs藥物的耐藥性相對(duì)較低,應(yīng)盡快開展新一代FQs藥物的藥敏試驗(yàn)。同時(shí),應(yīng)針對(duì)常見耐藥突變位點(diǎn),建立適合本地區(qū)的對(duì)FQs耐藥的快速檢測(cè)方法,盡早為合理使用FQs藥物治療MDR-TB提供依據(jù),以控制本地MDR-TB的傳播流行。

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