交叉引物恒溫擴增檢測技術(shù)在疑似肺結(jié)核患者臨床診斷中的價值

歐喜超 董海燕 夏輝 王勝芬 屈燕 趙冰 張治英 趙雁林

2017年WHO[1]報告估算全球共有1040萬例結(jié)核病新發(fā)患者，平均發(fā)病率為140/10萬，我國肺結(jié)核發(fā)病患者例數(shù)居第三位，僅次于印度和印度尼西亞。在2016年全球登記的540萬例新發(fā)和復(fù)發(fā)的肺結(jié)核患者中，有57%經(jīng)細(xì)菌學(xué)證實，其余患者根據(jù)其癥狀和胸部影像學(xué)檢查結(jié)果等被診斷為肺結(jié)核。目前，我國細(xì)菌學(xué)確診患者僅占31%；“十三五”全國結(jié)核病防治規(guī)劃明確提出，到2020年，要將確診肺結(jié)核患者的病原學(xué)陽性率提高到50%以上。因此，為確保就診患者能夠獲得準(zhǔn)確、可靠、及時的實驗室診斷結(jié)果，亟需加強結(jié)核病實驗室服務(wù)水平[2]。

高質(zhì)量的實驗室服務(wù)是實現(xiàn)對結(jié)核病患者進行正確診斷和治療的一個重要組成部分，為提高我國結(jié)核病實驗室的診斷能力，國家衛(wèi)生健康委員會與比爾及梅琳達·蓋茨基金會合作開展了若干評估新型結(jié)核病診斷工具的項目[3-5]，以期提高我國基層實驗室結(jié)核病患者的檢出率。筆者根據(jù)前期評估結(jié)果，選用經(jīng)濟、有效、易用的交叉引物恒溫擴增(cross-priming isothermal amplification, CPA)檢測技術(shù)[6-8]，進一步擴大樣本量，進入地市和縣(區(qū))級結(jié)核病實驗室開展示范應(yīng)用的可行性研究，驗證CPA檢測技術(shù)在縣(區(qū))級結(jié)核病防治機構(gòu)用于結(jié)核病診斷的可行性，并比較不同診斷技術(shù)組合對于提高活動性肺結(jié)核患者病原學(xué)檢測陽性率的影響。

材料和方法

1.研究對象：以2016年1—10月在廣東省佛山市結(jié)核病防治所、江門市結(jié)核病防治所、南海區(qū)疾病預(yù)防控制中心、三水區(qū)疾病防治所、新會區(qū)結(jié)核病防治所、開平市結(jié)核病防治所、臺山市結(jié)核病防治所、鶴山市慢性病防治站和恩平市慢性病防治站就診的疑似肺結(jié)核患者為研究對象，研究期間共納入6524例疑似肺結(jié)核患者，排除15例培養(yǎng)污染和2例CPA檢測無效，共6507例患者納入分析。由接受過培訓(xùn)的臨床醫(yī)生詳細(xì)詢問納入患者的一般信息、本次就診癥狀及病史，逐項確認(rèn)后填寫臨床信息表。納入患者均進行胸部影像學(xué)檢查，并送檢痰標(biāo)本到實驗室進行涂片鏡檢、固體培養(yǎng)和CPA檢測，實驗室對培養(yǎng)陽性菌株進行菌種鑒定(圖1)。

2.胸部影像學(xué)檢查：(1)成年人攝胸部正位X線片1張。(2)0～14歲兒童肺結(jié)核可疑癥狀者，先進行結(jié)核菌素皮膚試驗，強陽性者攝胸部正位X線片1張；胸部正位X線片顯示異常，則加攝1張X線側(cè)位片。

3.痰涂片檢查：涂片鏡檢遵照《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》[8]中的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序執(zhí)行。

4.分枝桿菌分離培養(yǎng)和菌種鑒定：固體培養(yǎng)試驗遵照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》[9]中的操作要求執(zhí)行。對于培養(yǎng)陽性標(biāo)本，實驗室人員選取生長狀態(tài)最好的陽性培養(yǎng)管，按照結(jié)核分枝桿菌抗原檢測試劑盒說明書的要求進行菌種鑒定。

5.CPA檢測：實驗室人員收到痰標(biāo)本后，優(yōu)先選取疑似肺結(jié)核患者的晨痰(無晨痰時可選夜間痰)進行CPA檢測，按照EasyNATTM結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(恒溫擴增-試紙條法)說明書的要求進行檢測。

6.診斷：臨床醫(yī)生根據(jù)實驗室檢查、胸片和臨床檢查結(jié)果等對納入患者進行綜合診斷，患者最終被診斷為涂陽肺結(jié)核、分子檢測陽性肺結(jié)核、僅培陽肺結(jié)核、臨床診斷肺結(jié)核和排除肺結(jié)核，培養(yǎng)與菌種鑒定結(jié)果用于糾正患者初診診斷結(jié)果，菌種鑒定結(jié)果為非結(jié)核分枝桿菌糾正患者診斷為“排除肺結(jié)核”；菌種鑒定結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌且初診診斷“排除肺結(jié)核”糾正患者診斷為“僅培陽肺結(jié)核”。診斷流程見圖2。全部納入患者完成后，國家級臨床專家對菌陰臨床診斷為肺結(jié)核患者和CPA陽性排除肺結(jié)核患者的診斷結(jié)果進行現(xiàn)場復(fù)核，國家級臨床專家復(fù)核后的診斷結(jié)果為最終診斷結(jié)果。

7.統(tǒng)計學(xué)處理：使用SPSS 17.50軟件，采用卡方檢驗對不同檢測方法的陽性檢出率進行比較分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、初診疑似肺結(jié)核患者實驗室檢測及臨床診斷結(jié)果

圖1 疑似肺結(jié)核患者臨床及實驗室檢查流程圖

圖2 患者診斷流程圖

在納入分析的6507例初診疑似肺結(jié)核患者中，涂片陽性1187例，涂片陽性率為18.2%；培養(yǎng)陽性1629例，培養(yǎng)陽性率為25.0%；CPA檢測陽性1555例，CPA檢測陽性率為23.9%，CPA檢測陽性率與培養(yǎng)陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.277，P>0.05)。3199例(49.2%)患者最終經(jīng)臨床診斷為活動性肺結(jié)核，3308例(50.8%)患者排除肺結(jié)核。

二、 活動性肺結(jié)核患者中涂片、培養(yǎng)和CPA聯(lián)合檢測結(jié)果

在3199例活動性肺結(jié)核患者中，涂片聯(lián)合培養(yǎng)檢測陽性患者1550例，檢測陽性率為48.5%(1550/3199)；涂片聯(lián)合CPA檢測陽性患者1531例，檢測陽性率為47.9%(1531/3199)；兩種聯(lián)合檢測結(jié)果的陽性檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.226，P>0.05)。涂片、培養(yǎng)和CPA三種方法聯(lián)合檢測時，檢測陽性患者1740例，檢測陽性率為54.4%(1740/3199)，除新會和鶴山外，其他7家單位活動性肺結(jié)核患者中病原學(xué)陽性率均達到50%。詳見表1。

三、 痰涂片、固體培養(yǎng)和CPA檢測診斷結(jié)核病的效能

以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，痰涂片診斷結(jié)核病的敏感度和特異度分別為35.0%和98.0%；固體培養(yǎng)診斷結(jié)核病的敏感度和特異度分別為46.4%和95.7%；CPA檢測診斷結(jié)核病的敏感度和特異度分別為44.6%和96.2%，見表2。

討 論

一、CPA檢測技術(shù)在縣(區(qū))級結(jié)核病防治機構(gòu)的推廣應(yīng)用價值

在我國縣(區(qū))級結(jié)核病定點醫(yī)療機構(gòu)，結(jié)核病的病原學(xué)診斷仍主要依靠涂片鏡檢。涂片鏡檢簡單、快速、特異度高、成本低廉，但敏感度較低，每毫升標(biāo)本中含量在5000～10 000條菌以上才能檢出。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)檢查是目前結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，如患者標(biāo)本通過培養(yǎng)試驗分離出結(jié)核分枝桿菌，可確診為結(jié)核病并具有傳染性。但是培養(yǎng)試驗用時較長，每周都需要觀察培養(yǎng)結(jié)果，至少需要1個月左右的時間才能獲得結(jié)果，操作過程中需要嚴(yán)格控制標(biāo)本前處理時間，對實驗人員的操作水平要求較高，并且培養(yǎng)陽性菌株還需要進行后續(xù)的菌種鑒定，才能確定患者是否感染結(jié)核分枝桿菌。之前已有研究表明[10-11]，在縣(區(qū))級結(jié)核病防治機構(gòu)，采用CPA檢測疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本是否含有結(jié)核分枝桿菌，CPA檢測結(jié)果報告時間比羅氏培養(yǎng)大大縮短，在不到1 d的時間內(nèi)即可報告實驗結(jié)果，且具有較高的檢測效能。本研究通過以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)CPA檢測的敏感度明顯高于涂片鏡檢，與固體培養(yǎng)試驗相當(dāng)。且CPA檢測不需要PCR儀等特殊儀器設(shè)備，只需要水浴鍋或金屬浴在63 ℃恒溫條件下就可實現(xiàn)靶核酸的擴增，實驗人員通過肉眼觀察試紙條上的條帶進行結(jié)果判讀，操作簡單方便；同時通過玻璃化技術(shù)保障擴增試劑可以在常溫下運輸，不需要冷鏈運輸。因此，CPA檢測技術(shù)適合在縣(區(qū))級結(jié)核病實驗室中推廣應(yīng)用。

表1 不同項目點臨床最終診斷為活動性肺結(jié)核患者的涂片、培養(yǎng)和CPA聯(lián)合檢測結(jié)果

表2 以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)對涂片、培養(yǎng)和CPA檢測診斷結(jié)核病的效能分析

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

二、CPA檢測技術(shù)在提高確診肺結(jié)核患者病原學(xué)陽性率中的作用

臨床上對肺結(jié)核患者的診斷仍存在一定的困難,常有過診或漏診發(fā)生，給結(jié)核病的防治工作帶來不利影響。2016年全球登記的540萬例肺結(jié)核患者(包括新發(fā)和復(fù)發(fā)患者)，只有57%的患者經(jīng)過細(xì)菌學(xué)驗證(如痰涂片、培養(yǎng)陽性，WHO推薦的快速診斷技術(shù)如GeneXpert MTB/RIF檢測陽性等)。剩下的43%尚未進行細(xì)菌學(xué)確診的患者都是根據(jù)臨床診斷結(jié)果最終確診(如癥狀體征、胸片檢查發(fā)現(xiàn)異常，或組織學(xué)檢查結(jié)果提示)。隨著結(jié)核分枝桿菌病原菌和宿主的不斷變化，結(jié)核感染患者的癥狀體征越來越不典型，部分患者無明顯癥狀，因此越來越多的學(xué)者認(rèn)為肺結(jié)核的診斷應(yīng)以細(xì)菌學(xué)實驗室檢查為主，結(jié)合胸部影像學(xué)、流行病學(xué)和臨床表現(xiàn)進行綜合診斷。本研究在縣(區(qū))級結(jié)核病防治機構(gòu)示范應(yīng)用了CPA檢測技術(shù)，證明其能很好地對傳統(tǒng)的實驗室檢測方法進行補充。當(dāng)單獨使用涂片、培養(yǎng)和CPA檢測時，活動性肺結(jié)核患者中病原學(xué)檢測陽性率均低于50%；當(dāng)聯(lián)合涂片和CPA檢測時，活動性肺結(jié)核患者中病原學(xué)檢測陽性率明顯提高，陽性檢出率達到47.9%；3種方法聯(lián)合檢測的陽性率則達54.4%。這一結(jié)果也表明，CPA檢測聯(lián)合傳統(tǒng)的涂片鏡檢和固體培養(yǎng)試驗在縣(區(qū))級醫(yī)療機構(gòu)用于結(jié)核病的診斷可顯著提高活動性肺結(jié)核患者中的病原學(xué)陽性檢出率。

三、小結(jié)

以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，CPA檢測技術(shù)的敏感度高于涂片鏡檢，與固體培養(yǎng)試驗相當(dāng)，但能明顯縮短疑似肺結(jié)核患者的確診時間?？h(區(qū))級結(jié)核病防治和定點醫(yī)療機構(gòu)可應(yīng)用CPA檢測技術(shù)代替固體培養(yǎng)用于疑似肺結(jié)核患者的診斷。有條件的實驗室可以采用多種診斷技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，進而提高活動性肺結(jié)核患者的病原學(xué)檢測陽性率。

志謝比爾及梅琳達·蓋茨基金會對本研究給予了大力支持。美國帕斯適宜衛(wèi)生科技組織(PATH)在項目設(shè)計、實施和數(shù)據(jù)分析過程中給予了協(xié)助。廣東省結(jié)核病控制中心、佛山市結(jié)核病防治所、江門市結(jié)核病防治所、南海區(qū)疾病預(yù)防控制中心、高明區(qū)慢性病防治站、三水區(qū)疾病防治所、新會區(qū)結(jié)核病防治所、開平市結(jié)核病防治所、臺山市結(jié)核病防治所、鶴山市慢性病防治站和恩平市慢性病防治站的實驗室和項目管理人員在項目實施過程中給予了各方面的支持和幫助。