篤斯越橘恒溫自然發(fā)酵的主要微生物初步鑒定及應(yīng)用

隋雙，周賽楠，王萍

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）

篤斯越橘（Vaccinium uliginosumL.）為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vacciniumspp.）落葉灌木，是我國(guó)重要的野生資源之一，主要分布在內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林和遼寧等地區(qū)[1,2]。它是一種果肉細(xì)膩、種子極小的小漿果，有很高的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值[2～4]。果實(shí)不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，而且含有有機(jī)酸、氨基酸、花色苷等獨(dú)特的功能性成分[5,6]，具有防治心血管疾病、抗癌、抗衰老等多種功效[7,8]。

自然發(fā)酵（一次傳統(tǒng)發(fā)酵）是一種古老的傳統(tǒng)發(fā)酵方式，利用天然微生物發(fā)酵而獲得最終產(chǎn)物[9]，發(fā)酵最初的目的是儲(chǔ)存食物、延長(zhǎng)食物保質(zhì)期，且發(fā)酵過(guò)程中依賴(lài)有益微生物的代謝產(chǎn)物來(lái)抑制大部分有害微生物的生長(zhǎng)，其食用安全性得到保證。發(fā)酵后的食品中活性物質(zhì)含量提高、營(yíng)養(yǎng)成分比例得到改善、活性物質(zhì)的生物活性得到提高。現(xiàn)在，利用果蔬通過(guò)益生菌在特定條件下發(fā)酵而成的功能性食品受到越來(lái)越多的人們認(rèn)可，其發(fā)酵產(chǎn)生了大量的次生代謝產(chǎn)物，具有調(diào)理腸胃、促進(jìn)消化吸收、抗氧化及提高免疫力等作用。自然發(fā)酵的過(guò)程極其復(fù)雜，在發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行代謝的微生物種類(lèi)繁多，研究證明發(fā)酵過(guò)程中的主要微生物包括乳酸菌類(lèi)、醋酸菌及各類(lèi)酵母等[10,11]，目前并未見(jiàn)到關(guān)于篤斯越橘自然發(fā)酵微生物組成的報(bào)道。

本人所研究的篤斯越橘自然發(fā)酵的結(jié)果表明，其發(fā)酵液中的活性物質(zhì)含量及抗氧化能力顯著升高（p<0.01），促使這些變化的主要是發(fā)酵液中的微生物，篤斯越橘自然發(fā)酵液是一個(gè)復(fù)雜的混合菌系，本文旨在探究篤斯越橘自然發(fā)酵液的主要微生物組成，并通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化鑒定分析出所分離菌株的種類(lèi)，并將篤斯越橘自然發(fā)酵液這一混合菌系作為初始發(fā)酵種子應(yīng)用于篤斯越橘人工發(fā)酵基質(zhì)，探究其發(fā)酵過(guò)程中活性物質(zhì)及抗氧化能力變化，將篤斯越橘自然發(fā)酵應(yīng)用于人工接種發(fā)酵，將兩者建立聯(lián)系，為篤斯越橘發(fā)酵工藝提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)樣品，以篤斯越橘為原料，選用市面常見(jiàn)白砂糖為碳源，使用前將白砂糖紫外殺菌30 min，在無(wú)菌條件下向已滅菌的玻璃瓶中，按質(zhì)量比1:4的比例加入已破碎的篤斯越橘和無(wú)菌飲用水，以及加糖量分別為 15%，20%，25%的白砂糖，將玻璃瓶封口，于恒溫培養(yǎng)箱25 ℃避光發(fā)酵60 d。

篤斯越橘，黑龍江省大興安嶺；白砂糖，市售；脫氧核糖、2-硫代巴比妥酸、TPTZ，上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純或生物制劑。

1.2 主要儀器

DH6000A型電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；5030-PVL高壓滅菌鍋，長(zhǎng)春百奧生物儀器有限公司；PB-10酸度計(jì)，德國(guó)Sartorius公司；WYT-4型手持糖度計(jì)，泉州中友儀器有限公司。

1.3 主要培養(yǎng)基

平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（VPBG）、MRS培養(yǎng)基、GY培養(yǎng)基、酵母膏麥芽培養(yǎng)基、真菌分離培養(yǎng)基（PDA）、細(xì)菌分離培養(yǎng)基（LB）、真菌鑒定及保藏培養(yǎng)基（CA）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 篤斯越橘恒溫自然發(fā)酵液微生物組成分析

取適量恒溫自然發(fā)酵的篤斯越橘發(fā)酵液，無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋后用平板計(jì)數(shù)法培養(yǎng)。分別用平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（VPBG）、MRS培養(yǎng)基、GY培養(yǎng)基、酵母膏麥芽培養(yǎng)基分別增補(bǔ)250 mg/L金霉素和259 mg/L氯霉素計(jì)數(shù)總需氧菌數(shù)、大腸桿菌、乳酸菌、醋酸菌、酵母菌和霉菌。

1.4.2 篤斯越橘恒溫自然發(fā)酵液微生物的分離與純化

取1 mL恒溫自然發(fā)酵的篤斯越橘發(fā)酵液于9 mL無(wú)菌生理鹽水中，震蕩搖勻后用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)∵m宜濃度分別涂布于PDA及LB培養(yǎng)基上，分別于28 ℃及37 ℃倒置培養(yǎng)后，挑取不同形態(tài)的菌體作平板劃線純化，將純化單一的菌體分別接種于 CA及MRS的斜面培養(yǎng)基上，于4 ℃保藏備用。

1.4.3 菌種初步分析

1.4.3.1 形態(tài)學(xué)及顯微形態(tài)觀察

將分離所得微生物接種于對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)好的微生物進(jìn)行菌落形態(tài)和顯微鏡觀察并記錄。

1.4.3.2 生理生化分析

（1）真菌的生理生化分析

分別進(jìn)行碳源利用試驗(yàn)、氮源利用試驗(yàn)和糖發(fā)酵試驗(yàn)[12]。

（2）細(xì)菌的生理生化分析

分別進(jìn)行革蘭氏染色、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)和碳源利用試驗(yàn)[13,14]。

1.4.4 篤斯越橘恒溫自然發(fā)酵液作為發(fā)酵種子的應(yīng)用

1.4.4.1 種子發(fā)酵基質(zhì)的制備

取篤斯越橘:無(wú)菌水(m/m)=1:6進(jìn)行打漿，加入白砂糖調(diào)整發(fā)酵基質(zhì)的初始糖度為15 °Bx，加入1 M小蘇打水溶液調(diào)整發(fā)酵基質(zhì)的初始pH值至4.80，進(jìn)行巴氏殺菌（70 ℃，30 min）后及時(shí)冷卻至室溫備用。

1.4.4.2 接種發(fā)酵

取加糖量15%組的篤斯越橘恒溫25 ℃發(fā)酵50 d的發(fā)酵液接入已滅菌的種子發(fā)酵基質(zhì)，接種量均為6%，置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)10 d，每隔1 d取樣測(cè)定pH值、還原糖含量、蛋白質(zhì)含量、總多酚含量、總黃酮含量、花色苷含量、原花青素含量、·OH清除率、總抗氧化能力。

1.4.5 測(cè)定方法

pH：pH計(jì)法測(cè)定。蛋白質(zhì)含量：考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定[15]。還原糖含量：DNS法測(cè)定[16]?？偡雍浚焊Ａ址臃y(cè)定[17]。黃酮含量：根據(jù)文獻(xiàn)[18]的方法，略有改動(dòng)。原花青素含量：采用香草醛-硫酸法測(cè)定[19]?；ㄉ蘸浚翰捎胮H示差法[20]測(cè)定?！H清除率：采用硫代巴比妥酸法（TBARS）測(cè)定，試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[20]并作適當(dāng)修改，用稀釋 10倍的發(fā)酵液進(jìn)行測(cè)定。總抗氧化能力：采用鐵離子還原/抗氧化力測(cè)定法（FRAP）測(cè)定，試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[21]。乙醇含量的測(cè)定：采用重鉻酸鉀-DNS比色法測(cè)定發(fā)酵液中的乙醇含量[22]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 篤斯越橘恒溫自然發(fā)酵液微生物組成分析

2.1.1 發(fā)酵過(guò)程中總需氧菌落數(shù)的變化

圖1 恒溫發(fā)酵過(guò)程中總需氧菌落數(shù)變化Fig.1 Changes in total aerobic colonies during constant temperature fermentation

篤斯越橘恒溫發(fā)酵過(guò)程中總需氧菌落數(shù)的變化趨勢(shì)如圖1所示。從圖1可以看出，三組發(fā)酵物的總需氧菌落數(shù)在0～10 d內(nèi)顯著升高（p<0.01），加糖量15%組的總需氧菌落數(shù)由0.90 Log（CFU/mL）升至7.00 Log（CFU/mL），加糖量20%組的總需氧菌落數(shù)由1.60 Log（CFU/mL）升至6.70 Log（CFU/mL），加糖量 25%組的總需氧菌落數(shù)由1.07 Log（CFU/mL）升至7.04 Log（CFU/mL）。發(fā)酵50 d之后，三組發(fā)酵物的總需氧菌落數(shù)數(shù)量級(jí)均達(dá)到106CFU/mL左右，分別為6.40 Log（CFU/mL）、6.00 Log（CFU/mL）、5.90 Log（CFU/mL）。發(fā)酵至60 d時(shí)，三組發(fā)酵物的總需氧菌落數(shù)略有降低。

2.1.2 發(fā)酵過(guò)程中大腸桿菌菌落數(shù)的變化

使用平板計(jì)數(shù)法監(jiān)測(cè)0 d、10 d、20 d、30 d、40 d、50 d、60 d發(fā)酵液中的大腸桿菌菌落數(shù)，其結(jié)果均為0 CFU/mL，結(jié)果表明發(fā)酵液中不存在大腸桿菌。

2.1.3 發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌活菌數(shù)的變化

圖2 恒溫發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌活菌數(shù)變化Fig.2 Changes in viable count of lactobacillus during constant temperature fermentation

篤斯越橘恒溫發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌活菌數(shù)的變化趨勢(shì)如圖2所示。從圖2可以看出，三組發(fā)酵物的乳酸菌活菌數(shù)在發(fā)酵0～12 d顯著升高（p<0.01），加糖量15%組的乳酸菌活菌數(shù)由 1.30 Log（CFU/mL）升至7.00 Log（CFU/mL），加糖量20%組的乳酸菌活菌數(shù)由1.26 Log（CFU/mL）升至6.81 Log（CFU/mL），加糖量25%組的乳酸菌活菌數(shù)由1.30 Log（CFU/mL）升至6.95 Log（CFU/mL），這段時(shí)間為乳酸菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期；在12～50 d內(nèi)趨于平穩(wěn)，此時(shí)為乳酸菌生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，發(fā)酵至50 d時(shí)，乳酸菌活菌數(shù)的數(shù)量級(jí)達(dá)106CFU/mL左右，分別為6.47 Log（CFU/mL）、6.11 Log（CFU/mL）、5.95 Log（CFU/mL）。發(fā)酵50 d內(nèi)，活菌數(shù)并未顯著降低，說(shuō)明此時(shí)乳酸菌并未走向衰落期。

2.1.4 發(fā)酵過(guò)程中醋酸菌菌落數(shù)的變化

篤斯越橘恒溫發(fā)酵過(guò)程中醋酸菌活菌數(shù)的變化趨勢(shì)如圖3所示。從圖3可以看出，三組發(fā)酵物的醋酸菌菌落數(shù)在0～10 d內(nèi)顯著升高（p<0.01），加糖量15%組的醋酸菌菌落數(shù)由1.98 Log（CFU/mL）升至6.75 Log（CFU/mL），加糖量20%組的醋酸菌菌落數(shù)由1.90 Log（CFU/mL）升至 7.04 Log（CFU/mL），加糖量 25%組的醋酸菌菌落數(shù)由2.01 Log（CFU/mL）升至6.38 Log（CFU/mL）。發(fā)酵50 d之后，三組發(fā)酵物的醋酸菌菌落數(shù)數(shù)量級(jí)均達(dá)到106CFU/mL左右，分別為6.18 Log（CFU/mL）、5.85 Log（CFU/mL）、5.70 Log（CFU/mL）。發(fā)酵至60 d時(shí)，三組發(fā)酵物的醋酸菌菌落數(shù)略有降低。

圖3 恒溫發(fā)酵過(guò)程中醋酸菌菌落數(shù)變化Fig.3 Changes in viable count of acetic acid bacteria during constant temperature fermentation

2.1.5 發(fā)酵過(guò)程中酵母菌菌落數(shù)的變化

圖4 恒溫發(fā)酵過(guò)程中酵母菌菌落數(shù)變化Fig.4 Changes in viable count of yeast during constant temperature fermentation

篤斯越橘恒溫發(fā)酵過(guò)程中酵母菌菌落數(shù)的變化趨勢(shì)如圖4所示。從圖4可以看出，三組發(fā)酵物的酵母菌菌落數(shù)在0～30 d內(nèi)顯著升高（p<0.01），加糖量15%組的酵母菌菌落數(shù)由2.94 Log（CFU/mL）升至5.60 Log（CFU/mL），加糖量20%組的酵母菌菌落數(shù)由2.67 Log（CFU/mL）升至 5.48 Log（CFU/mL），加糖量 25%組的酵母菌菌落數(shù)由3.12 Log（CFU/mL）升至6.23 Log（CFU/mL）。發(fā)酵50 d之后，三組發(fā)酵物的酵母菌菌落數(shù)數(shù)量級(jí)均達(dá)到106CFU/mL左右，分別為6.28 Log（CFU/mL）、6.04 Log（CFU/mL）、5.90 Log（CFU/mL）。發(fā)酵至60 d時(shí)，三組發(fā)酵物的酵母菌菌落數(shù)略有降低。

2.1.6 發(fā)酵過(guò)程中霉菌菌落數(shù)的變化

圖5 恒溫發(fā)酵過(guò)程中霉菌菌落數(shù)變化Fig.5 Changes in viable count of mold during constant temperature fermentation

篤斯越橘恒溫發(fā)酵過(guò)程中霉菌菌落數(shù)的變化趨勢(shì)如圖5所示。從圖5可以看出，三組發(fā)酵物的霉菌菌落數(shù)在0～30 d內(nèi)顯著升高（p<0.01）加糖量15%組的霉菌菌落數(shù)由 2.88 Log（CFU/mL）升至 5.78 Log（CFU/mL），加糖量20%組的霉菌菌落數(shù)由2.95 Log（CFU/mL）升至5.60 Log（CFU/mL），加糖量25%組的霉菌菌落數(shù)由3.42 Log（CFU/mL）升至6.52 Log（CFU/mL）。發(fā)酵50 d之后，三組發(fā)酵物的霉菌菌落數(shù)數(shù)量級(jí)均達(dá)到106CFU/mL左右，分別為6.26 Log（CFU/mL）、6.08 Log（CFU/mL）、6.00 Log（CFU/mL）。發(fā)酵至60 d時(shí)，三組發(fā)酵物的霉菌菌落數(shù)略有降低。

2.1.7 起始發(fā)酵種子的確定

表1 篤斯越橘自然發(fā)酵液各菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 1 Quantitative statistics of the number of colonies in naturally fermented Vaccinium uliginosum L.

發(fā)酵至50 d時(shí)，三組發(fā)酵物的各菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，加糖量15%組的篤斯越橘恒溫自然發(fā)酵液中的各菌落數(shù)顯著高于其余兩組（p<0.05），其中乳酸菌、醋酸菌、酵母菌及霉菌的活菌數(shù)數(shù)量級(jí)均在高于106CFU/mL，分別為（6.47±0.02）LogCFU/mL、（6.18±0.01）LogCFU/mL、（6.28±0.02）LogCFU/mL、（6.26±0.01）LogCFU/mL，選擇加糖量15%組的篤斯越橘恒溫自然發(fā)酵液為起始發(fā)酵種子。

2.2 篤斯越橘恒溫自然發(fā)酵液中分離菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

篤斯越橘自然發(fā)酵液中分離所得菌株的形態(tài)學(xué)特征見(jiàn)表2。

表2 篤斯越橘自然發(fā)酵液中分離所得菌株的形態(tài)學(xué)特征Table 2 Morphological characteristics of the strains isolated from naturally fermented Vaccinium uliginosum L.

根據(jù)表2，由菌落形態(tài)可知，菌株A系列的菌落濕潤(rùn)，圓形，經(jīng)染色觀察為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體呈球形、卵圓形或短桿狀，單個(gè)、成對(duì)或成鏈存在；菌株B系列的菌落圓形，表面光滑濕潤(rùn)，顏色呈乳白色，表面凸起，有淡香味，經(jīng)顯微鏡觀察為細(xì)胞圓形。參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》、《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》和《真菌鑒定手冊(cè)》，初步認(rèn)為菌株A系列為細(xì)菌，菌株B系列為酵母菌。對(duì)分離所得的菌株進(jìn)行生理生化鑒定，進(jìn)一步確定其分類(lèi)地位。

2.3 篤斯越橘恒溫自然發(fā)酵液中分離菌株的生理生化鑒定

2.3.1 細(xì)菌的生理生化鑒定

以A1、A2菌株為代表菌株，其生理生化的鑒定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 細(xì)菌的生理生化鑒定結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical identification of bacteria

由表3可知，菌株A1、A2革蘭氏染色均為陽(yáng)性，葡萄糖產(chǎn)酸為陽(yáng)性，均發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、纖維二糖和甘露醇，菌株A1還發(fā)酵阿拉伯糖和山梨醇。

參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[12]，初步認(rèn)為菌株A1為乳桿菌屬，菌株A2為鏈球菌屬。

2.3.2 酵母菌的生理生化鑒定

以B1菌株為代表菌株，其生理生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表4、表5。

由表4、5可知，菌株B1同化乙醇、棉子糖、乳糖，不同化麥芽糖、淀粉、D-木糖，在單一氮源培養(yǎng)基中不同化硝酸鈉和亞硝酸銨。菌株B1發(fā)酵乳糖、蔗糖、棉子糖、葡萄糖、半乳糖和麥芽糖，不發(fā)酵蜜二糖和海藻糖。參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[13]和《真菌鑒定手冊(cè)》[14]，認(rèn)為菌株B1為克魯維酵母屬。

2.4 篤斯越橘恒溫自然發(fā)酵液作為發(fā)酵種子的應(yīng)用結(jié)果

表4 酵母菌碳源利用試驗(yàn)及氮源利用試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of carbon and nitrogen assimilation tests for yeasts

表5 酵母菌糖發(fā)酵鑒定結(jié)果Table 5 Results of carbohydrate fermentation tests for yeasts

2.4.1 種子發(fā)酵過(guò)程中基本成分的變化

篤斯越橘種子發(fā)酵過(guò)程中基本成分的變化如圖 6所示。

圖6 種子發(fā)酵過(guò)程中基本成分的變化Fig.6 Changes in the basic ingredients during seed fermentation

由圖6可知，在發(fā)酵過(guò)程中pH值隨發(fā)酵時(shí)間持續(xù)降低，pH由4.8降至2.79，發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生有機(jī)酸，有機(jī)酸含量增高造成較低的pH環(huán)境，酸性環(huán)境可以有效抑制致病菌生長(zhǎng)，提高食品安全性，還可以為花

色苷的穩(wěn)定提供酸性環(huán)境；還原糖含量隨發(fā)酵時(shí)間在不斷地波動(dòng)上升與下降，整體呈下降趨勢(shì)，這是由于所添加的白砂糖主要成分是蔗糖，蔗糖是二糖，屬于非還原性糖，微生物需要先利用體系中的還原糖，待還原糖消耗之后，微生物產(chǎn)生的酶促使蔗糖分解成單糖，繼續(xù)被微生物消耗利用，說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程中微生物在不斷地利用還原糖用于代謝與生長(zhǎng)，發(fā)酵10 d時(shí)還原糖含量降至（106.98±1.43）mg/mL；蛋白質(zhì)含量隨發(fā)酵時(shí)間波動(dòng)變化，蛋白質(zhì)含量增加是由于微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中合成了蛋白質(zhì)或者微生物對(duì)篤斯越橘的分解利用使篤斯越橘中的蛋白質(zhì)逐漸溶解，并釋放到發(fā)酵液中，從而使發(fā)酵液的可溶性蛋白含量增加，蛋白質(zhì)含量降低是由于發(fā)酵液中的微生物利用蛋白質(zhì)用于代謝與生長(zhǎng)，發(fā)酵 10 d時(shí)蛋白質(zhì)含量為（0.3053±0.0015）mg/mL。

2.4.2 種子發(fā)酵過(guò)程中活性成分變化

篤斯越橘種子發(fā)酵過(guò)程中基本成分的變化如圖 7所示。

圖7 種子發(fā)酵過(guò)程中活性成分的變化Fig.7 Changes in the active substance during seed fermentation

由圖 7可知，總酚含量隨發(fā)酵時(shí)間顯著升高（p<0.01），發(fā)酵8 d時(shí)總酚含量提高了38.10%。黃酮含量0～3 d顯著升高（p<0.01），發(fā)酵3 d時(shí)達(dá)到最大值，提高了9.27%，發(fā)酵8 d時(shí)黃酮含量提高了5.69%?；ㄉ蘸侩S發(fā)酵時(shí)間波動(dòng)下降后波動(dòng)上升，發(fā)酵8 d花色苷含量下降了30.22%，發(fā)酵至9 d時(shí)花色苷含量又顯著升高（p<0.01）。原花青素含量隨發(fā)酵時(shí)間波動(dòng)下降，在0～1 d內(nèi)顯著下降（p<0.01），發(fā)酵至8 d時(shí)原花青素含量下降了31.26%。Filannino等[23]探討了乳酸菌發(fā)酵櫻桃汁和花椰菜濃漿混合物的過(guò)程，描述了發(fā)酵過(guò)程中酚類(lèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化規(guī)律，指出乳酸菌在代謝過(guò)程中將分子較大的酚類(lèi)物質(zhì)水解成小分子酚類(lèi)，酚類(lèi)物質(zhì)含量增加，這說(shuō)明篤斯越橘恒溫自然發(fā)酵液這一混合菌系作為起始發(fā)酵種子，其中乳酸菌的存在是總酚含量增加的主要原因；Ekinci等[24]研究了自然發(fā)酵黑胡蘿卜汁的化學(xué)及生物特性，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前后花色苷含量下降，原花青素含量增加，認(rèn)為發(fā)酵前后花色苷含量變化可能是由于發(fā)酵過(guò)程中微生物菌群合成的酶類(lèi)與酚類(lèi)化合物之間發(fā)生了復(fù)雜的相互作用，使酚類(lèi)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)有所改變，這間接解釋了種子發(fā)酵前期總酚含量的增加而花色苷含量降低；Escudero-López[25]等選用畢赤克魯維酵母對(duì)橙汁進(jìn)行發(fā)酵，比較了發(fā)酵前后幾種功能性物質(zhì)的含量，發(fā)現(xiàn)酒精發(fā)酵后橙汁中黃酮含量增加，而酚類(lèi)物質(zhì)在酒精發(fā)酵過(guò)程中可能與酵母或酵母代謝產(chǎn)生的蛋白質(zhì)吸附或結(jié)合而有所損失，相關(guān)性分析表明抗氧化能力的提高與黃酮含量增加有關(guān)，這說(shuō)明種子發(fā)酵前期0～3 d酒精發(fā)酵（酵母發(fā)酵）占主導(dǎo)，黃酮含量顯著提高（p<0.01），后期3～8 d乳酸發(fā)酵占主導(dǎo)，使得總酚含量顯著增加（p<0.01），發(fā)酵第8 d，發(fā)酵液的pH已降至2.80以下，這將為花色苷提供穩(wěn)定的酸性環(huán)境，使得花色苷含量在8～9 d有所升高。

2.4.3 種子發(fā)酵過(guò)程中抗氧化能力變化

圖8 種子發(fā)酵過(guò)程中抗氧化能力的變化Fig.8 Changes in the antioxidant capacity during seed fermentation

篤斯越橘發(fā)酵過(guò)程中抗氧化能力的變化如圖8所示。由圖8可知，發(fā)酵0～2 d，稀釋10倍發(fā)酵液的·OH清除率隨發(fā)酵時(shí)間顯著升高（p<0.01），·OH清除率提高了3.74%，2～10 d隨發(fā)酵時(shí)間波動(dòng)變化；總抗氧化能力0～9 d隨發(fā)酵時(shí)間顯著升高（p<0.01），總抗氧化能力提高了39.22%。發(fā)酵過(guò)程中酚類(lèi)化合物及黃酮類(lèi)化合物的大量增加是抗氧化能力增強(qiáng)的主要原因。果蔬中的抗氧化成分主要有多酚類(lèi)、類(lèi)胡蘿卜素、花色苷和生育酚等成分，酚類(lèi)化合物大多可以作為還原劑、金屬螯合劑、單線態(tài)氧猝滅劑和氫供體在體系中來(lái)發(fā)揮抗氧化功能[26]。許多種果蔬發(fā)酵食品的抗氧化性都是由于高濃度的多酚類(lèi)化合物的存在，有報(bào)告指出果酒類(lèi)和果醋類(lèi)的抗氧化性能都與總酚含量高度相關(guān)[27]。然而Naczk等[28]指出從果蔬發(fā)酵液中的提取的總酚并不能很好的預(yù)測(cè)其總抗氧化活性，說(shuō)明多酚類(lèi)物質(zhì)或其他成分與抗氧化能力之間存在協(xié)同關(guān)系。因此發(fā)酵后抗氧化性能的提高可能受到微生物種類(lèi)、發(fā)酵pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、原料種類(lèi)以及氧氣含量等多方面因素的影響。Marazz等[29]指出乳酸菌代謝過(guò)程中產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶等可以使復(fù)雜的酚類(lèi)化合物水解、異黃酮含量增加，而且乳酸菌本身可以作為金屬螯合劑發(fā)揮抗氧化功能。酵母菌作為真菌類(lèi)在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中不僅會(huì)產(chǎn)生相關(guān)的酶類(lèi)還會(huì)積累較多的蛋白質(zhì)、氨基酸和肽類(lèi)。許多氨基酸和活性肽類(lèi)具有金屬螯合作用及自由基清除作用，在體系中發(fā)揮其抗氧化活性[30]。

因此作為起始發(fā)酵種子的篤斯越橘發(fā)酵液，其中的乳酸菌及酵母菌的存在是抗氧化能力提高的關(guān)鍵，而醋酸菌的存在使得發(fā)酵風(fēng)味得到改善。

2.4.4 抗氧化能力陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果

抗氧化能力陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果如表6。由表6可以看出，種子發(fā)酵液的抗氧化能力顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組（p<0.01）。稀釋10倍的種子發(fā)酵液的·OH清除率顯著高于2 mg/mL Vc的·OH清除率（p<0.01），種子發(fā)酵液的總抗氧化能力顯著高于0.25 mg/mL Trolox的總抗氧化能力（p<0.01）。

表6 抗氧化能力陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果Table 6 Results of positive control for antioxidant capacity

3 結(jié)論

本文首先探究了篤斯越橘恒溫自然發(fā)酵液的微生物組成，其中主要微生物有乳酸菌、酵母菌、醋酸菌及霉菌；為了進(jìn)一步確定發(fā)酵液中的微生物區(qū)系，使用平板分離技術(shù)對(duì)發(fā)酵液中的微生物進(jìn)行分離與純化，對(duì)分離菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定及生理生化鑒定，得出菌株A1、A2為乳酸菌，其中菌株A1為乳桿菌屬，菌株A2為鏈球菌屬；菌株B1為酵母菌，菌株B1為克魯維酵母屬。篤斯越橘恒溫自然發(fā)酵液是一個(gè)混合菌系，將其作為起始發(fā)酵種子接種于已滅菌的篤斯越橘人工發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，探究其基本成分、活性成分及抗氧化能力隨發(fā)酵時(shí)間的變化，試驗(yàn)結(jié)果表明，總酚及黃酮含量對(duì)比發(fā)酵前分別提高了 38.10%、5.69%，花色苷及原花青素含量對(duì)比發(fā)酵前分別降低了30.22%、31.26%，·OH清除率及總抗氧化能力對(duì)比發(fā)酵前分別提高了3.74%、39.22%。種子發(fā)酵液的抗氧化能力顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組（p<0.01）。種子發(fā)酵液的·OH清除率顯著高于程勇杰[31]等人所研究的藍(lán)莓酵素產(chǎn)品（p<0.01）。種子發(fā)酵終產(chǎn)物的乙醇含量為0.98%，為低醇發(fā)酵物。