不同HLB值非離子型表面活性劑與粘蛋白的相互作用

程歡，唐傳核

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

粘蛋白（mucins）是一類高度水化的糖蛋白，其分子的核心蛋白鏈，由中間的糖基化區(qū)域和兩端的非糖基化區(qū)域組成[1]。粘蛋白是粘膜層的主要成分，具有保護(hù)、潤滑人體內(nèi)各種管腔，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控，吸收及包裹微生物和致病顆粒，以及其他防御功能[2～4]。研究表明，一些疾病的發(fā)生與粘蛋白有關(guān)。2017年 8月 16日，由德國馬克斯普朗克研究所的Thomas F. Meyer博士和美國斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員合作，在《Nature》上發(fā)文指出：幽門螺桿菌可能通過誘導(dǎo)胃粘膜下方干細(xì)胞的過度增殖，導(dǎo)致受感染患者的粘膜的特征性增厚，進(jìn)而誘導(dǎo)胃癌的發(fā)生[5]。由此可見，粘蛋白對(duì)人體的健康有著至關(guān)重要的作用。

口腔是消化道的始端，和胃腸道同屬消化器官，胃腸道是口腔環(huán)境在消化系統(tǒng)中的一種延伸，而口腔粘膜與胃粘膜有相似的組織學(xué)特征。近年，人體口腔唾液對(duì)口腔感官知覺方面的影響，尤其是攝入的食品組分與唾液蛋白相互作用產(chǎn)生澀味的口感[6～9]，引起了食品科學(xué)家的興趣，也引發(fā)研究者對(duì)唾液及其成分與食品組分相互作用的研究。大量研究表明，食品中的組分，如多酚，可導(dǎo)致口腔產(chǎn)生澀味[8～11]；乳清蛋白可引起口腔干燥[12～14]；而乳清蛋白穩(wěn)定的乳液使口腔產(chǎn)生乳脂狀，脂肪和厚度的感覺[15]；溶菌酶穩(wěn)定的乳液，則能導(dǎo)致口腔產(chǎn)生干燥，粗糙，和澀味口感[15,16]?；谶@些事實(shí)可知，唾液是食品口腔加工的必需成分，對(duì)感官知覺有著復(fù)雜的影響。在設(shè)計(jì)新產(chǎn)品時(shí)不僅要考慮產(chǎn)品的貨架期，也要考慮產(chǎn)品組分與唾液作用后的感官體驗(yàn)。

Span在食品中廣泛使用，尤其在飲料中，如植物蛋白飲料，調(diào)制乳等，常常用作乳化劑。Span安全、無毒、刺激性小[17]、且受酸堿鹽的影響較小、優(yōu)良乳化性能以及其它方面的特殊性能很好地滿足了不同行業(yè)的生產(chǎn)和需求，因而成為日化及食品領(lǐng)域廣受關(guān)注的表面活性劑類型[18]。但目前，人們對(duì)于食品中的組分Span系列非離子型表面活性劑的認(rèn)識(shí)還不夠深入，缺乏對(duì) Span系列非離子型表面活性劑與粘蛋白的相互作用及其對(duì)口腔感官影響的系統(tǒng)研究及報(bào)道?；谝陨峡紤]，本研究的主要目標(biāo)是探究常用的Span系列非離子型表面活性劑與粘蛋白相互作用的可能性，以期為食品工業(yè)開發(fā)新型的具備良好口感并有利健康的飲料給出一些建議。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

豬胃粘蛋白（type Ⅱ，結(jié)合唾液酸約為1%，）購于美國Sigma-Aldrich公司；非離子表面活性劑、山梨醇酐月桂酸酯（Span-20）、山梨糖醇酐單棕櫚酸酯（Span-40）、山梨醇酐單硬脂酸酯（Span-60）、山梨醇酐單油酸酯（Span-80）均由廣州潤華化工有限公司贈(zèng)予；尿素，廣東光華科技股份有限公司；十二烷基硫酸鈉，上海伯奧生物技術(shù)有限公司；其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Scientz-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫振蕩器，常州澳華儀器有限公司；哈希2100N臺(tái)式濁度儀，美國HACH公司；UV754N紫外可見分光光度計(jì)，上海精科儀器有限公司；PHS-3C精密pH計(jì)，上海雷磁儀器廠；78-1磁力攪拌器，常州澳華儀器有限公司；BCD-228UTM冰箱，合肥美的電冰箱有限公司；ME104E分析天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；Nanoscope 3A原子力顯微鏡，美國Veeco公司；Zetasizer Nano ZS激光納米粒度儀，英國Malvern公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人工唾液的制備

稱取一定量的粘蛋白（0.25%，m/V）分散于 pH為7的人工唾液中[19]，由于本實(shí)驗(yàn)不涉及淀粉的消化，故未添加α-淀粉酶。采用磁力攪拌2 h促進(jìn)溶解，用1 mol/L NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH至7.0，加入兩滴疊氮化鈉溶液（0.02%，m/V）抑制微生物生長，然后在4 ℃放置過夜使粘蛋白充分水化。貯藏之后在8000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min去除不溶雜質(zhì)，置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 非離子型表面活性劑的制備

Span-20溶液：稱取一定量的Span-20分散于pH為7的5 mM磷酸緩沖液中，配制濃度為0.1%（m/V），將置于燒杯中的Span-20溶液放入超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中，在10 mm探頭、285 W條件下超聲處理20 min，直至充分分散，待Span-20溶液在冰浴中恢復(fù)至室溫后，將其稀釋為不同濃度（0.1%，0.08%，0.06%，0.05%，0.04%，0.03%，0.02%和0.01%，m/V），攪拌待用；

Span-40、Span-60和Span-80溶液的制備方法同上，并稀釋為不同濃度備用。

1.2.3 粘蛋白-非離子型表面活性劑復(fù)合物的制備

將一系列不同濃度的Span-20、Span-40、Span-60和Span-80溶液（各自濃度均為0.1%，0.08%，0.06%，0.05%，0.04%，0.03%，0.02%和 0.01%，m/V），在37 ℃，振蕩頻率為150 r/min的搖床中，與等體積的人工唾液（含0.25%（m/V）粘蛋白）混合，并在搖床中振蕩25 min，充分反應(yīng)后的混合液于室溫保存待測(cè)。

1.2.4 粘蛋白-非離子型表面活性劑復(fù)合物濁度的測(cè)定

分別取5 mL反應(yīng)后的混合液于試管中，用哈希2100 N臺(tái)式濁度儀測(cè)其濁度值（NTU），記為NTUmixture。其中混合物的對(duì)照組有兩個(gè)，其一是人工唾液（含0.25%（m/V）粘蛋白）與等體積的5 mM磷酸緩沖液混合，其二是非離子型表面活性劑溶液與等體積的人工唾液（不含粘蛋白）混合。兩對(duì)照組在相同的條件下反應(yīng)后，測(cè)其濁度值分別記為NTUmucin，NTUsurfactant。

最終復(fù)合物的濁度值計(jì)算：

所有測(cè)量值都是在室溫條件下至少測(cè)定兩次，報(bào)告結(jié)果為超過三次讀數(shù)的平均值。

1.2.5 粘蛋白-非離子型表面活性劑復(fù)合物粒度的測(cè)定

粘蛋白-非離子型表面活性劑復(fù)合物的粒度通過動(dòng)態(tài)光散射（DLS）馬爾文電位-納米粒度儀（Zetasizer Nano ZS）來測(cè)定。測(cè)定復(fù)合物粒徑之前，含粘蛋白的人工唾液需要過膜（0.45 μm）處理，磷酸緩沖液也需要過膜（0.22 μm）處理。所有測(cè)量值都是在室溫條件下至少測(cè)定兩次，報(bào)告結(jié)果為超過三次讀數(shù)的平均值。

1.2.6 原子力顯微鏡（AFM）測(cè)量

原子力顯微鏡用以觀察蛋白顆粒的形貌、大小等信息。AFM觀察采用輕敲模式（Tapping Mode）成像，以及裝有-“G”型掃描探頭并由Nanoscope Ⅲa控制器驅(qū)動(dòng)的Dimension 3000顯微鏡。樣品用相同的緩沖液稀釋至大約50 μg/mL，渦旋10 s充分混勻后取10 μL稀釋樣品滴在新鮮剝離的云母片表面（8×8 mm），室溫下靜置過夜自然風(fēng)干。掃描條件：頻率300 kHz，速率1 Hz。使用NanoScope Analysis Version 1.40軟件分析獲得的圖片。

1.2.7 粘蛋白-非離子型表面活性劑復(fù)合物內(nèi)聚力的測(cè)定

粘蛋白-非離子型表面活性劑復(fù)合物用變性劑（6 mol/L urea、0.5% SDS）處理表征其相互作用的內(nèi)聚力，所用粘蛋白濃度為0.25%（m/V），表面活性劑濃度0.1%（m/V）；分別取4.0 mL混合物與4.0 mL等體積的變性劑混合，渦旋30 s混勻后靜置60 min，測(cè)定在λ=600 nm處的吸光度，以純水作為空白對(duì)照。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.6對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行畫圖，所有數(shù)據(jù)均采用平均值（Mean）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行一維方差分析（one-way ANOVA），以及置信區(qū)間為95%的顯著性分析，顯著性分析通過Tukey的多范圍檢驗(yàn)，顯著性水平被認(rèn)為是p＜0.05。所有圖表中采用相同的字母表示在p＜0.05水平差異不顯著，不同的字母表示差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 粘蛋白-非離子型表面活性劑復(fù)合物濁度的測(cè)定

由圖1可知，粘蛋白與特定的非離子型表面活性劑（Span-20、Span-40、Span-60或Span-80）形成復(fù)合物的濁度值，均隨著相應(yīng)非離子型表面活性劑濃度的增加而增大，其中粘蛋白-Span-60復(fù)合物濁度增大顯著。在選定的濃度下，不同 HLB值的非離子型表面活性劑與粘蛋白形成復(fù)合物的濁度不同。Span-80，Span-60，Span-40和Span-20的HLB值分別為4.3、4.7、6.5、8.6。在濃度一定時(shí)，隨著HLB值的減小，Span-20，Span-40和Span-60與粘蛋白形成的復(fù)合物濁度顯著增加。Span-80的HLB值低于Span-60，在相同濃度下，粘蛋白-Span-80的濁度值卻并明顯低于粘蛋白-Span-60的濁度值。并且隨著濃度的增大，粘蛋白-Span-80的濁度值變化較小，而粘蛋白-Span-60的濁度值變化顯著。粘蛋白分子既具有糖基化的親水區(qū)又有疏水區(qū)，同樣屬于兩親性分子，而疏水作用表現(xiàn)顯著[20]。而非離子型表面活性劑的疏水尾鏈主要影響非離子型表面活性劑與粘蛋白之間的疏水作用[21]。可能是由于Span-80極強(qiáng)的疏水性使得粘蛋白結(jié)構(gòu)重疊的程度更大，因此當(dāng)表面活性劑濃度增加時(shí)濁度變化較小。

由此推測(cè)，非離子型表面活性劑（Span-20、Span-40、Span-60或Span-80）與粘蛋白之間存在不同程度的相互作用，才導(dǎo)致相應(yīng)的復(fù)合物溶液濁度值發(fā)生不同程度的變化。

圖1 不同濃度和HLB值的非離子型表面活性劑與粘蛋白形成的復(fù)合物的濁度Fig.1 The turbidity of complexes which were formed between mucin and nonionic surfactants

圖2 粘蛋白-非離子型表面活性劑復(fù)合物平均粒徑隨變化Fig.2 Average particle size of mucin-nonionic surfactant complex varies at different nonionic surfactant concentrations

2.2 粘蛋白-非離子型表面活性劑復(fù)合物粒度的測(cè)定

不加入非離子型表面活性劑時(shí)，粘蛋白平均粒徑約為 88 nm。Thongborisute等[22]人所用豬胃粘蛋白（type Ⅱ）的平均粒徑為90～100 nm，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。由圖2知，在一定濃度下，從Span-20，Span-40到Span-60，隨著HLB值的減小，粘蛋白與非離子型表面活性劑形成的復(fù)合物的平均粒徑呈現(xiàn)依次增大的趨勢(shì)，其中粘蛋白-Span-60復(fù)合物的平均粒徑變化顯著。即Span-20、Span-40和Span-60與粘蛋白的相互作用強(qiáng)度與其HLB值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。隨著Span-80濃度從0.01%增加到0.1%，粘蛋白-Span-80復(fù)合物的平均粒徑變化較小，其粒徑分布圖也呈現(xiàn)了粘蛋白顆粒減小的粒徑分布。可能是由于加入Span-80后，使粘蛋白由松散的顆粒結(jié)構(gòu)逐漸變?yōu)榫o湊的顆粒。類似的報(bào)道有Nikogerorgos等人報(bào)道了小分子量的聚乙烯亞胺導(dǎo)致粘蛋白從松散的結(jié)構(gòu)變得更為緊湊[23]。還有J?bstl等提出多酚與松散的蛋白結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變小，其結(jié)構(gòu)變得更加緊湊，更趨近于球形[9]。

2.3 不同非離子型表面活性劑誘導(dǎo)粘蛋白聚集顆粒的AFM微觀形態(tài)

圖3 粘蛋白與不同非離子型表面活性劑相互作用后的原子力圖Fig.3 AFM images of various nonionic surfactants

為進(jìn)一步驗(yàn)證不同非離子型表面活性劑與粘蛋白相互作用，導(dǎo)致粘蛋白粒度分布不同的結(jié)果，對(duì)不同非離子型表面活性劑作用后的粘蛋白進(jìn)行AFM 微觀形態(tài)表征。圖3中展示了添加不同非離子型表面活性劑（Span-20、Span-40、Span-60和Span-80），粘蛋白及其聚集體原子力微觀圖。從圖3中可以看出，在依次添加Span-20、Span-40和Span-60后，粘蛋白顆粒的高度均展現(xiàn)不同程度的增大，分別為3.1～15.8 nm，3.1～19.2 nm，3.1～35.2 nm；即隨著 HLB 值的減?。⊿pan-20、Span-40、Span-60），粘蛋白顆粒的簇聚情況加強(qiáng)。這與前面粒度結(jié)果相吻合，即 Span-20、Span-40和 Span-60與粘蛋白的相互作用強(qiáng)度與其HLB值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。J?bstl等提出多酚與松散的蛋白結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變小，其結(jié)構(gòu)變得更加緊湊，更趨近于球形[9]。而在添加 Span-80后，粘蛋白顆粒的高度從3.1 nm降低為1.5 nm；這是由于Span-80具有超強(qiáng)的疏水性，Span-80與粘蛋白接觸，從而誘導(dǎo)粘蛋白結(jié)構(gòu)展開，內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露出來并與 Span-80通過疏水相互作用緊密結(jié)合，進(jìn)而形成更大的疏水核心，導(dǎo)致粘蛋白重疊時(shí)形成更為緊湊，不規(guī)則的結(jié)構(gòu)。這些顆粒聚集物在吸附到界面后可能由于內(nèi)部作用力的強(qiáng)弱而發(fā)生不同的變化，從而對(duì)其乳液的性質(zhì)產(chǎn)生影響。

2.4 內(nèi)聚力的測(cè)定

圖4 粘蛋白-非離子型表面活性劑復(fù)合物在不同蛋白變性劑溶液處理后的濁度。Fig.4 Influence of various protein-perturbing solvents on the turbidity of mucin-nonionic surfactant complex

為了明確維持粘蛋白-表面活性劑復(fù)合物顆粒內(nèi)部作用力，通過在不同的蛋白變性劑存在條件下顆粒分散液的濁度來反映。實(shí)驗(yàn)所采用的變性劑有6 mol/L urea、0.5% SDS以及它們同時(shí)存在的組合，一般情況下認(rèn)為urea和SDS分別能夠破壞氫鍵、疏水相互作用[24,25]。首先由圖4能夠看到單獨(dú)的6 mol/L urea和0.5% SDS與粘蛋白-非離子型表面活性劑復(fù)合物等體積混合之后，粘蛋白-非離子型表面活性劑復(fù)合物的濁度均呈現(xiàn)不同程度的下降。而在兩種變性劑共同作用于粘蛋白-表面活性劑復(fù)合物時(shí)，粘蛋白-表面活性劑復(fù)合物的濁度均顯著降低。

粘蛋白分子具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)。其一，粘蛋白分子的瓶刷狀寡糖側(cè)鏈含有大量羥基，能通過氫鍵作用形成水合層；其二，粘蛋白分子既具有糖基化的親水區(qū)又有疏水區(qū)，屬于兩親性分子，而疏水作用表現(xiàn)顯著[20]。由此可知，粘蛋白分子能通過氫鍵作用和疏水相互作用與非離子型表面活性劑發(fā)生作用，進(jìn)而對(duì)粘蛋白的聚集體大小產(chǎn)生影響。因此，可以合理的推測(cè)粘蛋白與Span-20、Span-40、Span-60或Span-80形成復(fù)合物的作用力包含疏水相互作用和氫鍵。

3 結(jié)論

3.1 濁度測(cè)定結(jié)果表明，在濃度一定時(shí)，粘蛋白-Span復(fù)合物的濁度隨著 HLB值從 Span-20、Span-40到Span-60的減小而顯著增加；隨著濃度的增加，粘蛋白-Span-60復(fù)合物濁度顯著增大，而粘蛋白-Span-80復(fù)合物濁度變化較小。粒度測(cè)定結(jié)果表明，在濃度一定時(shí)，粘蛋白-Span復(fù)合物平均粒徑隨著 HLB值從Span-20、Span-40到Span-60的減小而逐漸增大，其中粘蛋白-Span-60復(fù)合物的平均粒徑變化顯著，粘蛋白-Span-80復(fù)合物平均粒徑變化較小。即 Span-20、Span-40和 Span-60與粘蛋白形成復(fù)合物的濁度和平均粒徑均與其HLB值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

3.2 對(duì)于Span-20、Span-40和Span-60，其誘導(dǎo)粘蛋白形成聚集體顆粒的大小也與其 HLB值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，這均歸因于粘蛋白與Span系列非離子型表面活性劑間的非共價(jià)作用力(氫鍵和疏水相互作用)。HLB依次減小的Span-20、Span-40和Span-60，表面活性劑的脂肪鏈長度依次增大。而Span-80與Span-60脂肪鏈長度相同，但是Span-80脂肪鏈中含有不飽和的碳碳雙鍵，使得 Span-80具有超強(qiáng)的疏水性。因而Span-80與粘蛋白接觸，誘導(dǎo)粘蛋白結(jié)構(gòu)展開而使其內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露出來，并通過疏水相互作用緊密結(jié)合，進(jìn)而形成更大的疏水核心，導(dǎo)致粘蛋白重疊時(shí)形成更為緊湊，不規(guī)則的結(jié)構(gòu)。