黃芪升麻柴胡治療實驗性自身免疫性重癥肌無力大鼠的量效關(guān)系及免疫學(xué)機(jī)制研究①

何驍雋 吳顥昕 吳周燁 許夢賢 許駿堯 陳 剛 陶偉偉

(南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,南京210023)

重癥肌無力(Myasthenia gravis，MG)是乙酰膽堿受體抗體(Acetylcholinergic receptor antibody，AchR-Ab)介導(dǎo)的、細(xì)胞免疫依賴的和補體參與的神經(jīng)-肌肉接頭(Neuromuscularjunction，NMJ)處傳遞障礙的自身免疫性疾病，病變主要累及NMJ突觸后膜上乙酰膽堿受體(Acetylcholinergic receptor，AChR)，是一種比較常見的神經(jīng)肌肉疾病。其機(jī)制為多重因素參與刺激AchR產(chǎn)生的AchR-Ab，與AchR結(jié)合并使其內(nèi)吞或降解，阻斷AchR與乙酰膽堿結(jié)合，激活補體形成膜攻擊復(fù)合物，破壞NMJ突觸后膜，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)興奮性遞質(zhì)傳遞障礙[1]。

MG現(xiàn)代醫(yī)學(xué)目前尚無特效治療藥物。臨床藥物長期使用?？砂殡S一系列不良反應(yīng)[2,3]。中醫(yī)藥憑借其獨特的理論體系，以“益氣升提”為基本治法，從整體出發(fā)，辨證論治，給予患者個性化的治療，在減小毒藥物的副作用，改善患者的生活質(zhì)量方面具有很好的效果。已有的臨床實驗證明，以補中益氣湯與升陷湯為代表，益氣升提法對MG有確切的治療效果。黃芪、柴胡、升麻是補中益氣湯與升陷湯的共同組成部分，也是益氣升提法的代表。一項對30年間中醫(yī)藥治療MG文獻(xiàn)的研究表明，黃芪使用頻率最高，升麻柴胡分別排在使用頻率的第五和第六位[4]?？梢哉J(rèn)為黃芪、升麻、柴胡是益氣升提法治療MG的代表結(jié)構(gòu)。然而臨床應(yīng)用黃芪與柴胡、升麻配伍治療MG時，升麻與柴胡二藥用量相對固定，但黃芪用量變化較大，從30～150 g不等。黃芪與升麻柴胡配伍治療的最佳劑量以及其免疫機(jī)制一直是有待進(jìn)一步研究的內(nèi)容。

在前期研究中，本課題組已經(jīng)驗證“益氣升提法”的代表方劑升陷湯對治療重癥肌無力確有其效[5,6]，在將升陷湯按治則治法拆方研究后，發(fā)現(xiàn)其中益氣升提組(黃芪、升麻、柴胡)對MG療效最為顯著[7]?，F(xiàn)為進(jìn)一步探究，本實驗將不同劑量黃芪與柴胡升麻配伍治療EAMG，以重癥肌無力綜合評分評價其治療效果，探究其量效關(guān)系及相關(guān)的免疫機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑

1.1.1動物 SPF級雌性Lewis大鼠50只，體質(zhì)量140～160 g，6～8周齡，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2013-0016。飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)腦病SPF級動物實驗室，選用標(biāo)準(zhǔn)無菌飼料喂養(yǎng)，動物實驗室晝夜各12 h，通風(fēng)與消毒條件正常。

1.1.2藥物 藥物購于南京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂，藥材品質(zhì)由南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院腦病實驗室陶偉偉進(jìn)行鑒定。

1.1.3試劑 鼠源AchR-α亞基97-116肽(Rα97-116)：DGDFAIVKFTKVLLDYTGHI，由蘇州強(qiáng)耀生物科技有限公司合成。完全弗氏佐劑(Complete freund′s adjuvant，CFA)、不完全弗氏佐劑(Incompl-ete freund′s adjuvant，IFA)：美國Sigma公司。H37Ra干粉：美國Difco Bacto公司。Fixation/Permeabilization Kit、FITC-anti rat CD4、FITC anti rat CD25：美國BD公司。Antimouse/rat Foxp3 PE：美國eBioscience公司。大鼠AChR-Ab、轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factor-β，TGF-β)、干擾素γ(Interferon-γ，IFN-γ)、IL-6、IL-17 ELISA試劑盒：南京金益柏生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1實驗動物模型建立 本實驗參考Na等和Baggi等[8]方法建立EAMG模型，通過人工合成AChR多肽，構(gòu)建EAMG模型[9]。第1天將與完全弗氏佐劑(CFA)充分混勻的200 μl乳劑(含Rα97-116 50 μg、H37Ra干粉1 mg)，多點皮下注射于造模大鼠肩背部、尾基部、足墊部；佐劑對照組注射等量PBS與CFA混勻的乳劑。第30、45天，將與不完全弗氏佐劑(IFA)充分混勻的乳劑200 μl(含Rα97-116 50 μg)，在相同部位注射強(qiáng)化免疫；佐劑對照組注射等量PBS與IFA混勻的乳劑。第60天為造模結(jié)束。

1.2.2實驗動物模型及治療效果評估 為了精細(xì)客觀地比較各給藥組的治療效果與造模情況，本研究將Lenon評分中各項內(nèi)容具體量化，對EAMG大鼠按抓力、體質(zhì)量、低頻重復(fù)神經(jīng)電刺激(Repetitive nerve stimulation，RNS)衰減率、血清AchR-Ab含量，進(jìn)行MG綜合評分。

模型評估:對體質(zhì)量、抓力、血清AchR-Ab含量分別評分，再匯總進(jìn)行綜合評分?？偡?0分，各指標(biāo)：抓力20分，體質(zhì)量20分，AchR-Ab 30分；各項指標(biāo)的具體評分，按其與佐劑對照組對應(yīng)指標(biāo)相關(guān)性程度打分，P<0.05為60%，P<0.01為80%，P<0.001為100%，無相關(guān)性或陰性結(jié)果計為0分。綜合評分超過42分被認(rèn)為EAMG造模成功大鼠。模型評估綜合評分里不包括肌電圖的檢測，因檢測肌電圖須進(jìn)行麻醉，EAMG大鼠受麻醉易致死。

治療效果評估:對抓力、體質(zhì)量、肌電圖、血清AchR-Ab含量分別評分，再匯總進(jìn)行綜合評分。總分100分，各指標(biāo)：抓力20分，體質(zhì)量20分，肌電圖30分，血清AchR-Ab滴度30分，其中肌電圖3、5、10 Hz各占10分。各項指標(biāo)具體評分，按其與模型對照組對應(yīng)指標(biāo)相關(guān)性程度打分，P<0.05為60%，P<0.01為80%，P<0.001為100%，無相關(guān)性或為陰性結(jié)果計為0分。

例如，給藥后低劑量組抓力與模型對照組抓力相比顯著上升(P<0.01)，則低劑量組抓力治療效果評分為20×80%=16分。

1.2.3分組及給藥 造模之前隨機(jī)選出10只大鼠作為佐劑對照組，其余造模，末次免疫后2周對造模大鼠評估，將造模大鼠隨機(jī)分為模型對照組，益氣升提黃芪低劑量組(以下簡稱“低劑量組”)，益氣升提黃芪中劑量組(以下簡稱“中劑量組”)，益氣升提黃芪高劑量組(以下簡稱“高劑量組”)，每組10只。各中藥組藥物劑量如下——低劑量組：黃芪20 g，柴胡10 g，升麻10 g，中劑量組：黃芪40 g，柴胡10 g，升麻10 g，高劑量組：黃芪80 g，柴胡10 g，升麻10 g。實際給藥劑量根據(jù)人體體質(zhì)量折算，相當(dāng)于成人等效劑量的8倍。

1.2.4檢測指標(biāo)及方法

1.2.4.1體質(zhì)量 實驗期間每10 d記錄體質(zhì)量。

1.2.4.2抓力 實驗期間每隔10 d測抓力3次，取最大值。

1.2.4.3低頻重復(fù)神經(jīng)電刺激(Repetitive nerve stimulation，RNS)衰減率(D) 參照許文華等[10]方法進(jìn)行，10%水合氯醛按30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后固定，選用BL-420S生物機(jī)能系統(tǒng)進(jìn)行檢測，取4根針灸針作為電極，將刺激電極置于坐骨神經(jīng)附近肌肉內(nèi)，參考電極置于腹部皮下，記錄電極1、2分別插入同側(cè)腓腸肌內(nèi)側(cè)頭、跟腱附著處，分別以3、5、10 Hz頻率連續(xù)10次電刺激。計算RNS衰減率(D)，D(%)=(動作電位1-動作電位5)/動作電位1×100%。

1.2.4.4ELISA檢測大鼠外周血AChR-Ab、IL-6、IL-17、TGF-β、IFN-γ水平 第3次免疫15 d后尾靜脈取血，靜置30 min，3 000 r/min、4℃離心15 min，提取血清，-20℃保存，檢驗AchR-Ab水平。給藥結(jié)束后經(jīng)頸動脈取血，血清提取方法同前，嚴(yán)格按照試劑盒說明檢測。

1.2.4.5流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測定大鼠外周血淋巴細(xì)胞CD4+CD25+FoxP3+Treg比例 給藥結(jié)束后，大鼠眼眶取血2 ml，50 μl EDTA(1.5%)抗凝，等體積PBS稀釋獲得稀釋全血，加入0.9%氯化鈉溶液和大鼠淋巴細(xì)胞分離液，800 g離心30 min，PBS清洗3次，獲得外周血淋巴細(xì)胞，嚴(yán)格按照CD4-APC、CD25-FITC、FoxP3-PE抗體說明檢測。

2 結(jié)果

2.1給藥前后大鼠體質(zhì)量變化 見圖1、表1。各組大鼠在實驗開始第1天，體質(zhì)量無顯著性差異。造模后，各模型組大鼠與佐劑對照組相比，體質(zhì)量均顯著下降(P<0.001)。給藥后，與模型對照組相比較，低中高劑量組大鼠體質(zhì)量均顯著上升(P<0.01,P<0.001)。

2.2給藥前后大鼠抓力變化 見圖2、表2。造模后(第3次免疫后15 d，即60 d)，各組大鼠抓力與佐劑對照組相比，均顯著下降(P<0.001)。給藥后，與給藥前相比較，低中高劑量組大鼠抓力均顯著上升(P<0.001)；與模型對照組相比較，低劑量組與高劑量組抓力顯著上升(P<0.01,P<0.05)。

圖1 大鼠體質(zhì)量變化(n=10)Fig.1 Weight of rats(n=10)

GroupsWeightAfter modelingAfter taking drugsCFA 236.75±6.85235.53±2.74EAMG model198.00±2.003)187.94±26.943)Low dose177.18±17.073)206.55±11.192)Middle dose198.61±5.863)216.64±6.191)High dose206.37±9.113)210.84±10.232)

Note：Compared with EAMG model,1)P<0.01，2)P<0.001;compared with CFA,3)P<0.001.

2.3給藥后大鼠RNS衰減率變化 見圖3。給藥后，在不同條件電刺激下，模型對照組大鼠RNS衰減率均為最高，與佐劑對照組相比有顯著性差異(P<0.01,P<0.001)。與模型對照組相比，在3 Hz與5 Hz刺激下，低中高劑量組RNS衰減率均顯著下降(P<0.01,P<0.001)；在10 Hz刺激下，低劑量組和高劑量組RNS衰減率顯著下降(P<0.05，P<0.01)。

2.4給藥前后大鼠血清AChR-Ab含量 見表3。

圖2 大鼠抓力變化(n=10)Fig.2 Holding power of rats(n=10)

GroupsHolding powerAfter modelingAfter taking drugsCFA 15.49±1.1713.96±0.79EAMG model11.18±0.813)10.72±1.563)Low dose11.05±0.023)13.07±0.912)4)Middle dose10.31±0.293)12.03±0.964)High dose11.34±0.503)13.52±1.071)4)

Note：Compared with EAMG model,1)P<0.01，2)P<0.001;compared with CFA,3)P<0.001；compared with after modeling,4)P<0.001.

圖3 給藥后大鼠RNS衰減率變化(n=10)Fig.3 Decrement percentage of RNS after taking drugs (n=10)Note:Compared with EAMG model,*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001；compared with CFA,###.P<0.001.

造模后，除佐劑對照組外各組大鼠血清AChR-Ab含量均顯著升高(P<0.05,P<0.01)。給藥后，與模型對照組比較，低中高劑量組AChR-Ab含量均顯著下降(P<0.05,P<0.01)。

2.5給藥后大鼠血清TGF-β、IFN-γ、IL-6、IL-17含量 見表4。給藥后，與模型對照組相比較，低中高劑量組大鼠血清TGF-β含量均顯著升高(P<0.05，P<0.01)，IFN-γ、IL-6含量均顯著降低(P<0.001)，低劑量組與高劑量組血清IL-17含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)。

2.6給藥后大鼠外周血淋巴細(xì)胞CD4+CD25+FoxP3+Treg比例 見圖4、表5。給藥后，與佐劑對照組比較，模型對照組CD4+CD25+FoxP3+Treg比例顯著降低(P<0.05)；與模型對照組比較，高劑量組CD4+CD25+FoxP3+Treg比例顯著升高(P<0.05)。

2.7EAMG大鼠模型綜合評分 見表6。造模后，對各模型組大鼠EAMG表現(xiàn)進(jìn)行綜合評分，模型對照組70分，低劑量組70分，中劑量組58分，高劑量組64分，均符合EAMG模型評分要求。

2.8各組治療效果綜合評分 見表7。給藥后，對治療效果進(jìn)行綜合評分，低劑量組82分，中劑量組58分，高劑量組88分。

AchR-AbAfter modelingAfter taking drugsCFA 652.23±134.92 718.26±69.62 EAMG model 985.32±116.563)1 122.85±92.525)Low dose 992.85±103.454) 891.00±49.751)Middle dose 925.03±132.823) 765.74±75.642)High dose1 000.35±80.344) 797.11±108.372)

Note：Compared with EAMG model,1)P<0.05，2)P<0.01;compared with CFA,3)P<0.05，4)P<0.01，5)P<0.001.

GroupsTGF-βIFN-γIL-6IL-17CFA 168.40±3.671099.08±19.24 65.02±1.48 51.65± 5.35EAMG model125.33±4.305)1 467.31±124.145)80.61±12.265)71.11±5.295)Low dose151.90±4.301)1 120.15±80.483)71.35±3.213)59.82±1.741)Middle dose156.12±7.242)1 106.19±103.013)73.35±4.542)73.39±4.16High dose142.44±7.261)1 162.28±57.003)73.78±1.672)4)61.86±4.992)

Note：Compared with EAMG model,1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001;compared with CFA,4)P<0.05,5)P<0.001.

圖4 給藥后大鼠外周血淋巴細(xì)胞CD4+CD25+ FoxP3+Treg比例Fig.4 Proportion of CD4+CD25+FoxP3+Treg in peripheral blood lymphocytes after taking drugsNote:A.CFA;B.EAMG model;C.Low dose;D.Middle dose;E.High dose.

GroupsCD4+(%)CD25+FoxP3+(%)CD4+CD25+FoxP3+(%)CFA 47.06±8.141.28±0.120.60±0.04EAMG model50.66±5.170.60±0.113)0.31±0.082)Low dose47.53±3.451.11±0.151)0.53±0.11Middle dose49.67±8.770.98±0.010.50±0.14High dose58.00±11.080.96±0.160.62±0.111)

Note：compared with EAMG model,1)P<0.05;compared with CFA,2)P<0.01,3)P<0.001.

表6造模后各組大鼠EAMG模型評估綜合評分

Tab.6EAMGcomprehensivescoreofratsafterestablishingtheEAMGmodel

GroupsHolding powerWeightAchR-AbTotal scoreCFA 20203070Low dose20202464Middle dose20201858High dose20202464

表7給藥后各組治療效果綜合評分

Tab.7EAMGcomprehensivescoreofratsaftertakingdrugs

Holding powerWeightDecrement of RNS3 Hz5 Hz10 HzAchR-AbTotal scoreLow dose202081061882Middle dose01681002458High dose1620101082488

3 討論

新近的免疫學(xué)理論認(rèn)為 Th1、Th2、Th17 和Treg四種輔助性Th細(xì)胞亞群的平衡，在包括 MG 在內(nèi)的自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中起到了重要的作用。在EAMG發(fā)病的早期時相,Th1、Th2、Th17 細(xì)胞的比例下降,Treg 細(xì)胞比例上升；在EAMG發(fā)病的高峰期和晚期時相，Th1和Th17細(xì)胞的比例顯著上升,Th2和Treg細(xì)胞的比例顯著下降[11]。細(xì)胞因子在這細(xì)胞亞群的分化方向上起著重要作用[12]。

IFN-γ是由Th1型淋巴細(xì)胞分泌的促炎性因子，在MG發(fā)病過程中可介導(dǎo)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)使T細(xì)胞遷移到炎性反應(yīng)部位并放大炎性反應(yīng)，導(dǎo)致促炎性因子的生產(chǎn)[13]，還能夠增加MHCⅡ類分子的表達(dá)、激活巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞成熟，促進(jìn)AchR-Ab的產(chǎn)生、進(jìn)而誘發(fā)EAMG[14,15]。本實驗中給藥后模型組血清TGF-β含量上升，中藥組降低。

IL-6是B細(xì)胞終末分化并分泌抗體的必需因子，可以誘導(dǎo)T細(xì)胞的活化、增殖和分化，促進(jìn)T細(xì)胞表達(dá)IL-2R和IL-2[16]。研究表明IL-6協(xié)同TGF-β可以誘導(dǎo)CD4+初始T細(xì)胞分化成Th17細(xì)胞，并能促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化[17]。對EAMG小鼠給予抗IL-6抗體可以下調(diào)Th17相關(guān)基因IL-17、IL-17R、IL-23R和IL-21水平，降低小鼠AChR-Ab滴度和B細(xì)胞數(shù)量[18]。本實驗中給藥后模型組血清IL-6含量上升，中藥組降低。TGF-β是由Th3型淋巴細(xì)胞分泌的內(nèi)源性免疫抑制性細(xì)胞因子，是MG發(fā)病中的負(fù)調(diào)節(jié)因素[19]，可以抑制乙酰膽堿特異性T細(xì)胞和B細(xì)胞增殖，并抑制IFN-γ的生成[20]。TGF-β表達(dá)與AchR-Ab含量變化呈負(fù)相關(guān)[21],其含量降低可導(dǎo)致FoxP3表達(dá)降低，增加AchR-Ab表達(dá)。本實驗中給藥后模型組血清TGF-β含量降低，中藥組上升。

IL-17是由Th17型淋巴細(xì)胞分泌的促炎性細(xì)胞因子，可作用于自身抗原,增強(qiáng)自身免疫應(yīng)答引起自身免疫反應(yīng),在介導(dǎo)EAMG中有重要作用[22]。有研究利用基因敲除法證實IL-17參與了EAMG的發(fā)病過程[23]。EAMG病程中B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫、抗AchR抗體的產(chǎn)生依賴于CD4+IL-17的表達(dá)[24]。本實驗中給藥后模型組血清IL-17含量上升，中藥組降低。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory cells,Treg)主要產(chǎn)生于胸腺，是一種功能成熟的T細(xì)胞亞群，具有抑制效應(yīng)性T細(xì)胞增殖活化，降低促炎性因子水平的功能。Treg細(xì)胞的比值下降與EAMG的發(fā)病有著密切關(guān)系[15]，其最重要的表型標(biāo)記是CD4+CD25+FoxP3+，F(xiàn)oxP3+是Treg的特異性轉(zhuǎn)錄因子[25,26]。AchR-Ab水平和FoxP3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[27]。FoxP3水平可以被TGF-β上調(diào)，與RORγt基因配合，減少IL-17產(chǎn)生和表達(dá)[15]。本實驗中給藥后模型組血清Treg含量上升，中藥組降低。

中醫(yī)歷代文獻(xiàn)中并無“重癥肌無力”病名的記載。根據(jù)其眼瞼下垂、四肢無力、吞咽無力等特征表現(xiàn)，重癥肌無力被歸屬于《內(nèi)經(jīng)》所說的“痿證”范疇?！秲?nèi)經(jīng)》提出“治痿獨取陽明”的治療觀點，認(rèn)為本病之責(zé)在于脾，脾氣虛衰，則肌肉無力，四肢不用。治當(dāng)益氣健脾，升中舉陷。在MG的臨床治療中，各名老中醫(yī)均以益氣升提為基本治法，鄧鐵濤教授[28]提出了“重補脾胃，益氣升陷，兼治五臟”的治療大法。王新志教授[29]認(rèn)為本病以大氣下陷為主要病機(jī)。

“益氣升提法”是針對脾虛氣陷而設(shè)，脾居中焦，乃氣機(jī)升降之要沖。若脾虛氣陷，則清陽不升。經(jīng)云：“下者舉之。”“衰者補之。”(《素問至真要大論》)又云“氣虛宜掣引之?！?《素問·陰陽應(yīng)象大論》)本法選藥組方雙管齊下，既補中焦之氣，又舉下陷之清陽。黃芪、升麻、柴胡三者為益氣升提法的代表結(jié)構(gòu)。黃芪既善補氣，又善升氣，能補五臟諸虛(《本草逢原》)；柴胡為少陽之藥，能引大氣之陷者自左上升；升麻為陽明之藥，能引大氣之陷者自右上升。現(xiàn)代藥理研究也表明，上述三藥內(nèi)含有多種有效成分具有免疫調(diào)節(jié)作用。黃芪有效成分黃芪多糖可誘導(dǎo)T細(xì)胞增生，黃芪甲苷對T、B淋巴細(xì)胞增殖、腹腔巨噬細(xì)胞功能等都有影響[30]。柴胡可使T淋巴細(xì)胞增殖能力提高，增加Th1和Th2型細(xì)胞因子產(chǎn)生[31]，升麻可使藥物活性成分入血后及時向組織分布和消除，維持血漿中的藥物濃度。

黃芪臨床使用劑量變化較大，其作用也各不相同。現(xiàn)代研究表明，黃芪對細(xì)胞因子及免疫功能的調(diào)節(jié)作用與其劑量有關(guān)。侯天祿等[32]發(fā)現(xiàn)，黃芪總酮可使肝硬化模型SD大鼠肝組織TGF-βR1表達(dá)降低，高劑量組顯著低于低劑量組。陰永輝等[33]發(fā)現(xiàn)，黃芪與當(dāng)歸按不同配比均能抑制糖尿病模型大鼠IL-6的表達(dá)，其中當(dāng)黃芪當(dāng)歸3∶2 作用最為顯著。高光平等[34]研究發(fā)現(xiàn)紫黃散(內(nèi)含黃芪提取物)可使免疫抑制模型的昆明小鼠增強(qiáng)免疫，抑制血清IL-2、IL-4和IFN-γ水平，其中以中劑量效果最佳。劉言振等[35]對昆明小鼠給予單味黃芪水煎液，發(fā)現(xiàn)在一定濃度下，黃芪水煎液劑量增大與機(jī)體免疫力成正比，超過一定劑量范圍，變化不再明顯。李麗君等[36]研究發(fā)現(xiàn)大劑量黃芪當(dāng)歸按5∶1 配比能明顯改善肺纖維化模型的IPF小鼠生存質(zhì)量，抑制Th17分化關(guān)鍵基因TGF-β、IL-6、RORγmRNA的表達(dá)，促進(jìn)Treg分化關(guān)鍵基因FoxP3mRNA的表達(dá)水平。本研究顯示，MG綜合評分：低劑量組82分，中劑量組58分，高劑量組88分，給藥后各中藥組大鼠EAMG癥狀均有所好轉(zhuǎn)，體質(zhì)量上升，抓力上升，RNS衰減率顯著降低，血清TGF-β含量均顯著上升，AChR-Ab、IFN-γ、IL-6、IL-17含量均顯著降低。其中，低劑量組與高劑量組MG綜合評分較為接近，并且對綜合評分涉及的體質(zhì)量、抓力、RNS衰減、血清AchR-Ab含量均有明顯改善，但考慮到高劑量組CD4+CD25+FoxP3+Treg比例顯著上升，與模型組相比有顯著性差異，認(rèn)為高劑量組療效優(yōu)于低劑量組。中劑量組的MG綜合評分較低，主要是因為對抓力的提升不夠明顯，但中劑量組抓力給藥后與給藥前相比較，是顯著上升的，并且中劑量組在MG的特異性指標(biāo)肌電圖衰減率和AchR-Ab的治療效果上略優(yōu)于低劑量組，故認(rèn)為中劑量組與低劑量組治療效果較為接近。根據(jù)以上結(jié)果，可以認(rèn)為在20 g、40 g、80 g三劑量中，黃芪配伍升麻柴胡治療MG的最佳劑量為80 g。通常認(rèn)為，低劑量黃芪可以益氣固表，高劑量黃芪可以升陽舉陷。MG固然有氣虛表現(xiàn)，然而更應(yīng)屬于中氣下陷之重癥，故益氣升提法低劑量與中劑量黃芪益氣固表具有一定治療效果，但想要進(jìn)一步治療，還需要加大黃芪劑量行升陽舉陷之力。在上述其他學(xué)者的研究中，黃芪最佳劑量以其研究對應(yīng)的中劑量與高劑量居多，且在超過一定劑量后，黃芪對免疫的調(diào)節(jié)作用不再隨劑量增大而明顯增大。因此，我們認(rèn)為黃芪配伍升麻柴胡治療MG的最佳劑量可能為80 g或者更多，在繼續(xù)加大黃芪的劑量后，對MG的治療效果可能會有進(jìn)一步增強(qiáng)，也可能不再有顯著的提升，這還需要再做進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果表明，益氣升提法對EAMG有明確的治療效果，其中不同劑量黃芪配伍升麻柴胡，治療效果存在一定區(qū)別，對細(xì)胞因子的影響也具有差別。高劑量黃芪(80 g)配伍升麻柴胡的療效最為優(yōu)秀，低劑量(20 g)與中劑量(40 g)也都具有顯著的治療效果，但不如高劑量。益氣升提法治療EAMG的免疫機(jī)制可能是通過上調(diào)TGF-β水平，下調(diào)IFN-γ、IL-6、IL-17水平，上調(diào)FoxP3+的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)使CD4+CD25+FoxP3+Treg比例升高，調(diào)節(jié)Th1與Th2細(xì)胞比例，加強(qiáng)自身免疫抑制，減輕機(jī)體自身免疫應(yīng)答，調(diào)控淋巴細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)因子，使其恢復(fù)免疫平衡穩(wěn)態(tài)，降低AchR-Ab水平，減輕NMJ處AchR損傷，緩解臨床癥狀，從而達(dá)到治療效果。以MG綜合評分對治療效果做評估，將獨立的癥狀表現(xiàn)與指標(biāo)檢測結(jié)果綜合匯總，設(shè)立明確的衡量標(biāo)準(zhǔn)，能夠使對MG治療效果的評價更客觀具體。在接下來實驗設(shè)計中，可以進(jìn)一步完善MG綜合評分，加入更多評分項目，合理分配各項指標(biāo)比重，更全面地體現(xiàn)對MG的治療評估。