尼氏體的甲苯胺藍(lán)組織塊染色法

劉同慎 李 冰 羅慧瓊 駱倩倩 龐 敏

(濱州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)管理中心形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 煙臺(tái) 264003)

尼氏體是神經(jīng)元的特征性結(jié)構(gòu)之一，為神經(jīng)元結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和功能蛋白質(zhì)的合成部位，其數(shù)量和分布與神經(jīng)元的功能狀態(tài)密切相關(guān)，在形態(tài)學(xué)研究中常常需要特殊染色進(jìn)行顯示。本文對(duì)應(yīng)用甲苯胺藍(lán)顯示貓神經(jīng)元尼氏體的組織塊染色技術(shù)進(jìn)行了探索，并獲得了較為滿意的效果，特報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 甲苯胺藍(lán)染色液的配制

甲苯胺藍(lán)1g，蒸餾水100ml，磁力攪拌器攪拌至少12h。染色前配制，過(guò)濾后使用。

1.2 動(dòng)物

健康成年貓4只，雌雄不限，每只體質(zhì)量約1.5kg。

1.3 取材和固定

腹腔內(nèi)注射1%的水合氯醛水溶液對(duì)動(dòng)物深度麻醉(150mg/kg)。取出脊髓，留取頸膨大和腰膨大部位，垂直橫切成段，每段長(zhǎng)約0.5cm，共24塊。立刻將組織塊投入10%甲醛固定液固定24h。

1.3 組織塊染色

組織塊經(jīng)蒸餾水充分洗滌后，將其分為4組，每組6塊。分別入甲苯胺藍(lán)染色液，37℃染色。I～I(xiàn)V組分別染色2、4、8d和16d。

1.4 組織塊石蠟包埋

Ⅰ～Ⅳ組組織塊染色時(shí)間完成后，分別按照下列相同程序進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋： 50%乙醇脫水1h；75%乙醇脫水1h；95%乙醇Ⅰ脫水2h；95%乙醇Ⅱ脫水2h；100%乙醇Ⅰ脫水2h；100%乙醇Ⅱ脫水2h；二甲苯Ⅰ透明1.5h；二甲苯Ⅱ透明1.5h；石蠟Ⅰ浸蠟1h；石蠟Ⅱ浸蠟2h；石蠟Ⅲ浸蠟2h；包埋蠟(含有1%的蜂蠟)包埋。

1.5 切片、裱片和封片

旋轉(zhuǎn)切片機(jī)切片，厚5μm。載玻片裱片，恒溫干燥箱烘干，二甲苯脫蠟，中性樹膠封固。

1.6 觀察

應(yīng)用普通光學(xué)顯微鏡，高倍鏡下觀察比較各組的染色情況，并拍照記錄。

2 結(jié)果

高倍鏡下顯示，Ⅰ組和Ⅱ組切片標(biāo)本上的神經(jīng)元胞體和樹突呈現(xiàn)較為均勻的藍(lán)色，尼氏體不清晰，核仁藍(lán)色，背景無(wú)色(圖1A、1B)；Ⅲ組和Ⅳ組，尼氏體位于神經(jīng)元的胞體和樹突內(nèi)，顆粒狀或者斑塊狀，呈藍(lán)色，清晰可辨，核仁藍(lán)色，背景無(wú)色(圖1C、1D)。

圖1 甲苯胺藍(lán)組織塊染色的神經(jīng)元和尼氏體，×400A： 染色2d;B: 染色4d；C： 染色8d；D： 染色16d

3 討論

在與神經(jīng)科學(xué)相關(guān)的形態(tài)學(xué)研究中，神經(jīng)元是觀察的重點(diǎn)內(nèi)容之一，而由粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體組成的尼氏體位于神經(jīng)元的胞體和樹突內(nèi)，是神經(jīng)元的重要特征性結(jié)構(gòu)之一，與神經(jīng)元的功能狀態(tài)密切相關(guān)。神經(jīng)元在正常狀態(tài)下，尼氏體一般都有比較固定的形態(tài)[1]。而當(dāng)神經(jīng)元受到損傷時(shí)，尼氏體的變化最為敏感，主要表現(xiàn)為尼氏體的溶解和消失。在常規(guī)HE染色切片標(biāo)本上，尼氏體的形態(tài)變化并不是很明顯[2]，當(dāng)需要判斷神經(jīng)元的損傷程度或者判別顯示的細(xì)胞是否是神經(jīng)元的時(shí)候，往往需要尋求做尼氏體染色[3]。尼氏體的主要化學(xué)成分是核糖核酸和蛋白質(zhì)，有核外染色質(zhì)之稱[3]，與堿性染料如甲苯胺藍(lán)、硫堇等具有親和力，其中甲苯胺藍(lán)染色是最為常用的顯示尼氏體的傳統(tǒng)方法。但是，甲苯胺藍(lán)在顯示尼氏體和核仁為藍(lán)色的同時(shí)，背景也呈現(xiàn)淺藍(lán)色，致使尼氏體的清晰度和分辨效果較差[4]，極大地影響對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的形態(tài)學(xué)觀察、判斷和分析。

從現(xiàn)有的文獻(xiàn)資料分析發(fā)現(xiàn)，特染尼氏體大都是采用片染技術(shù)，即先進(jìn)行組織切片，再進(jìn)行染色[2，4]。而將組織制作成組織切片，是一個(gè)耗時(shí)的繁瑣過(guò)程，要經(jīng)過(guò)組織處理、切片、裱片、烤片、切片的脫蠟和水化等多個(gè)程序。在此過(guò)程中，組織需要經(jīng)過(guò)脫水劑、透明劑等化學(xué)試劑處理，并經(jīng)受浸蠟和烤片的高溫。這些化學(xué)試劑和高溫，對(duì)于尼氏體的嗜色性及其與染料的親和力都可能存在較大影響，致使片染時(shí)出現(xiàn)尼氏體不著色或者著色淺、背景有不應(yīng)有的著色等現(xiàn)象。組織塊染色是將經(jīng)過(guò)固定的組織先進(jìn)行染色后，再進(jìn)行組織處理和石蠟包埋切片程序[5]。故塊染技術(shù)避免了化學(xué)試劑和高溫對(duì)于尼氏體嗜色性的影響，染色結(jié)果較為真實(shí)地反映出組織結(jié)構(gòu)成分特有的嗜色特性。本文采用的甲苯胺藍(lán)對(duì)脊髓灰質(zhì)神經(jīng)元的尼氏體進(jìn)行組織塊染色技術(shù)，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)未見有報(bào)道。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，塊染2～4d能夠顯示神經(jīng)元的全貌，但尼氏體結(jié)構(gòu)和分布不夠清晰。隨著染色時(shí)間的延長(zhǎng)，至塊染8d，脊髓神經(jīng)元尼氏體可以清晰分辨，呈顆粒狀或者斑塊狀，分布于神經(jīng)元的胞體和樹突內(nèi)，軸突內(nèi)未見，背景基本無(wú)色。所以，8d可做為脊髓神經(jīng)元尼氏體塊染的最佳時(shí)間。在相同條件下，我們進(jìn)一步將此最佳時(shí)間成倍增加(16d)，染色結(jié)果與最佳染色時(shí)間并無(wú)差異，說(shuō)明尼氏體在達(dá)到與染料最大結(jié)合后，加長(zhǎng)染色時(shí)間并沒有出現(xiàn)過(guò)度著色現(xiàn)象。

甲苯胺藍(lán)組織塊染色顯示脊髓神經(jīng)元的尼氏體，特異性強(qiáng)，無(wú)沉淀，無(wú)背景著色，結(jié)果穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)方法具有可操作性和重復(fù)性。在組織學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)以及與神經(jīng)科學(xué)相關(guān)的形態(tài)學(xué)研究中，應(yīng)用甲苯胺藍(lán)進(jìn)行脊髓組織塊染顯示尼氏體，具有一定的推廣和應(yīng)用價(jià)值。