胰島素樣生長(zhǎng)因子-1對(duì)氧化損傷精子的保護(hù)作用

劉文靜 李月梅 王 磊 張榮玲 高建軍

山東省濰坊市婦幼保健院 （濰坊 261011）

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是指化學(xué)性質(zhì)活潑、氧化能力很強(qiáng)的一類含氧物質(zhì)，主要包括H2O2、羥基（-OH）、活性氮類（NO）等。過量的ROS引起的氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致男性不育的重要病因[1]，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生過多的因素包括吸煙、生殖道感染、精索靜脈曲張、環(huán)境污染物以及實(shí)驗(yàn)室精液處理等。研究證實(shí)，過量ROS會(huì)導(dǎo)致精子膜、線粒體及核DNA受損，使精子運(yùn)動(dòng)功能改變，并導(dǎo)致受精能力下降[2,3]。因此尋找有效的抗氧化物質(zhì)，降低ROS造成的氧化損傷成為目前男性不育的研究熱點(diǎn)。

胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）具有促進(jìn)有絲分裂、抗細(xì)胞凋亡等胰島素樣生物學(xué)效應(yīng)，涉及生殖細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過程。許多報(bào)道顯示IGF-1具有抗氧化、抗細(xì)胞凋亡的作用[4,5]，但是IGF-1對(duì)精子氧化損傷時(shí)產(chǎn)生的作用目前鮮有報(bào)道。本研究旨在觀察IGF-1對(duì)人精子體外氧化損傷時(shí)產(chǎn)生的作用。

材料與方法

一、材料

收集2015年1月至5月來濰坊市婦幼保健院生殖健康科查體的健康且有生育力的男性精液28例（志愿者），按照第5版《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》[6]（以下簡(jiǎn)稱第5版《WHO》）進(jìn)行檢測(cè)。納入標(biāo)準(zhǔn)：液化時(shí)間在60min內(nèi)，精子濃度＞60×106/mL，精子前向運(yùn)動(dòng)率（PR）＞32%，精液體積＞1.5 mL，正常形態(tài)精子比率＞4%，白細(xì)胞濃度＜1×106/mL。本實(shí)驗(yàn)通過本院倫理委員會(huì)審查，并與志愿者簽署知情同意書。

二、主要試劑與儀器

IGF-1購自美國PeproTech公司；Diff-Quik試劑盒購自深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司；DNA碎片率檢測(cè)試劑盒購自深圳博銳德生物科技有限公司；丙二醛（MDA）試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；精子培養(yǎng)液SpermRinse購自瑞士vitrolife公司；計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（CASA）使用清華同方精子分析儀。

三、精子懸液制備

男方禁欲3～7 d，手淫法留取精液。待精液充分液化后采用直接上游法處理精液：取精液1.5mL加入試管底部，在其上方緩慢加入等體積的培養(yǎng)液SpermRinse，將試管傾斜45°。于37℃培養(yǎng)箱放置30 min, 輕輕吸取上層云霧狀液體，300×g，離心5 min，棄上清，加入培養(yǎng)液，將精子濃度調(diào)整為10×106/mL。

四、實(shí)驗(yàn)分組

每例精子懸液平均分成4份，實(shí)驗(yàn)分為4組。對(duì)照組：僅精子懸液；H2O2組：精子懸液+100μmol/L H2O2；25ng/mL IGF-1組：精子懸液+25ng/mL IGF-1+100μmol/L H2O2；50ng/mLIGF-1組：精子懸液+50ng/mL IGF-1+100μmol/L H2O2。各組樣本置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，分別于12 h、24 h后進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)。

五、檢測(cè)指標(biāo)

（一）精子活力檢測(cè)

于培養(yǎng)后12 h及24 h，按照第5版《WHO》標(biāo)準(zhǔn)，采用CASA分析對(duì)各組精子進(jìn)行活力檢測(cè)，記錄各組精子活力、PR。

（二） 精子形態(tài)學(xué)分析

將各組精子懸液涂片，自然晾干后，采用Diff-Quik染色法進(jìn)行染色，按第5版《WHO》嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)法進(jìn)行判別，計(jì)數(shù)正常形態(tài)及畸形精子，記錄各組正常形態(tài)精子比率。

（三）精子DNA碎片率的檢測(cè)

按照試劑盒說明書，采用精子染色質(zhì)擴(kuò)散法檢測(cè)精子DNA碎片率。（1）精液標(biāo)本處理：取出精子懸液60μL加入已熔化的易熔凝膠管中，充分混勻；加30μL精子凝膠混合液于預(yù)先處理的載玻片上，迅速蓋上蓋玻片, 置于2～8℃冰箱5 min，使其凝固。（2）變性處理：從冰箱中取出載玻片，小心移去蓋片。將載玻片浸入反應(yīng)液A內(nèi)，20～28℃反應(yīng)7 min, 然后于反應(yīng)液B內(nèi)20～28℃反應(yīng)25 min, 再將載玻片浸入大量的純化水中5 min；（3）脫水、干燥、染色：將載玻片依次放入70%、90%和100%乙醇中脫水各2 min。空氣中自然干燥后以瑞氏染液染色，室溫15min后用流水輕輕沖洗染片；（4）光學(xué)顯微鏡觀察：普通光學(xué)顯微鏡高倍鏡下觀察500個(gè)精子，計(jì)數(shù)存在DNA碎片率的精子數(shù)量。

（四）MDA的檢測(cè)

采用硫巴比妥酸法（TBA）檢測(cè)精子脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA，按試劑盒說明書操作方法測(cè)定MDA含量，用分光光度計(jì)讀取吸光度值，根據(jù)精子濃度平衡后的MDA值以nmol/109精子表示。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組精子活力比較

在培養(yǎng)后12h及24h，與H2O2組比較，對(duì)照組活力及PR均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；在培養(yǎng)后12h及24h 50ng/mL IGF-1組與H2O2組比較，活力和PR均有提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；另外，在培養(yǎng)后24 h，25ng/mL IGF-1組PR較H2O2組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

二、各組正常形態(tài)精子比率、DNA碎片率比較

在培養(yǎng)后12h及24h，各組間正常形態(tài)精子比率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在培養(yǎng)后12h及24h，與H2O2組比較，對(duì)照組及50ng/mL IGF-1組DNA碎片率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）；在培養(yǎng)后24 h，25ng/mL IGF-1組DNA碎片率較H2O2組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

三、 各組精子MDA水平比較

在培養(yǎng)后12 h及24 h，對(duì)照組MDA水平較H2O2組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；50ng/mL IGF-1組與H2O2組比較，50ng/mL IGF-1組MDA水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。另外，培養(yǎng)后24 h，25ng/mL IGF-1組與H2O2組比較，25ng/mL IGF-1組MDA水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表1 各組精子活力及PR比較（±s）

表1 各組精子活力及PR比較（±s）

與H2O2組比較，*P＜0.05，** P＜0.01

PR(%)12h 24h 12h 24h對(duì)照組 87.43±2.93** 73.47±5.89** 81.75±3.63** 59.53±5.58**H2O2組 80.27±4.87 59.28±6.57 70.63±5.19 45.51±7.78 25ng/mL IGF-1組 83.08±3.76 62.93±5.43 72.81±4.94 51.47±5.83*50ng/mL IGF-1組 86.35±2.42* 72.14±4.97** 76.57±4.43* 56.13±4.69**組別 活力(%)

表2 各組正常形態(tài)精子比率、DNA碎片率比較（±s）

表2 各組正常形態(tài)精子比率、DNA碎片率比較（±s）

與H2O2組比較，*P＜0.05， ** P＜0.01

組別 正常形態(tài)精子比率(%) DNA碎片率(%)12h 24h 12h 24h對(duì)照組 11.05±3.41 11.56±3.04 4.73±1.15* 8.26±1.72**H2O2組 10.68±2.64 10.56±2.48 6.14±1.38 13.63±2.05 25ng/mL IGF-1組 10.42±2.26 11.14±2.73 5.78±1.66 11.71±1.69*50ng/mL IGF-1組 10.86±3.29 10.67±2.50 5.27±1.43* 10.45±1.87**

表3 各組精子MDA水平比較（±s）

表3 各組精子MDA水平比較（±s）

與H2O2組比較，*P＜0.05， **P＜0.01

組別 MDA(nmol/109精子)12h 24h對(duì)照組 17.32±3.96* 24.83±4.66**H2O2組 24.97±6.53 37.16±6.74 25ng/mL IGF-1組 23.04±5.15 33.42±6.07*50ng/mL IGF-1組 20.57±4.91* 31.54±5.32*

討 論

越來越多的研究表明IGF-1對(duì)睪丸功能起著重要的調(diào)節(jié)作用，IGF-1通過旁分泌/自分泌調(diào)節(jié)睪丸的發(fā)育和功能。IGF-1缺陷可導(dǎo)致Leydig細(xì)胞體積和數(shù)量減少，睪酮水平下降及精子數(shù)量減少[7]。研究顯示IGF-1受體存在于精原細(xì)胞、精母細(xì)胞及精子中，IGF-1可能對(duì)精子的產(chǎn)生、成熟及活力發(fā)揮著重要的作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)IGF-1對(duì)低溫培養(yǎng)及冷凍保存的精子有保護(hù)作用[9,10]，因此IGF-1對(duì)精子氧化損傷時(shí)產(chǎn)生的作用是一個(gè)值得探討的問題。

活性氧（ROS）能引起精子細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，并且損傷精子線粒體從而導(dǎo)致精子活動(dòng)力下降[11]。本研究顯示，在培養(yǎng)后12 h及24 h ，H2O2組的精子前向運(yùn)動(dòng)百分比及活力較對(duì)照組均下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明ROS導(dǎo)致精子運(yùn)動(dòng)能力下降。50ng/mL IGF-1組的精子活力及前向運(yùn)動(dòng)百分比較H2O2組均顯著上升（P＜0.05），提示適當(dāng)濃度的IGF-1能明顯降低ROS對(duì)精子運(yùn)動(dòng)能力的損傷。

本研究中，在培養(yǎng)后12 h及24 h ，各組間正常形態(tài)精子比率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。精子在生成過程中經(jīng)過一系列的變化而形成了精子特定的形態(tài)，因此精子形態(tài)是經(jīng)過一定時(shí)間和復(fù)雜的變化而形成的，在短時(shí)間內(nèi)，ROS介導(dǎo)的過氧化反應(yīng)并未引起精子形態(tài)的明顯改變。但H2O2會(huì)造成精子超微結(jié)構(gòu)的哪些改變以及IGF-1對(duì)此結(jié)構(gòu)損傷是否有改善作用還需進(jìn)一步研究。

精子DNA完整性對(duì)精卵結(jié)合和胚胎發(fā)育具有重要意義，與輔助生殖技術(shù)也密切相關(guān)，DNA完整性的破壞可從精子濃度、活力及受精能力等各方面影響精子。研究證實(shí)，氧化應(yīng)激是造成精子DNA損傷的主要原因，DNA堿基對(duì)氧化應(yīng)激敏感，活性氧自由基能與其反應(yīng)引起堿基修飾、DNA鏈斷裂以及染色質(zhì)交聯(lián)[12]。本研究采用精子染色質(zhì)擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)精子DNA碎片率，結(jié)果顯示，H2O2組精子DNA碎片率較對(duì)照組均明顯升高，25ng/mL IGF-1組在培養(yǎng)后24 h、50ng/mL IGF-1組在培養(yǎng)后12 h及24 h DNA碎片率較H2O2組均明顯下降，提示IGF-1能在一定程度上抑制ROS對(duì)精子DNA的損傷，保護(hù)精子DNA的完整性。

MDA是ROS攻擊精子細(xì)胞膜產(chǎn)生的主要脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，MDA的水平可間接反映ROS對(duì)精子的損害程度。有報(bào)道IGF-1能夠提高超氧化物歧化酶（SOD）含量，降低MDA水平，具有一定的抗自由基的作用[4,5]。本研究結(jié)果顯示50ng/mL IGF-1組MDA水平明顯低于H2O2組，說明IGF-1可以降低ROS引起的精子脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而保護(hù)精子的運(yùn)動(dòng)功能，降低精子的DNA損傷。

無論是精子活力還是DNA碎片率各組間比較，均顯示50ng/mL IGF-1組具有明顯的保護(hù)作用。本研究顯示，IGF-1對(duì)活性氧導(dǎo)致的精子運(yùn)動(dòng)功能下降及DNA損傷具有一定的保護(hù)作用，為IGF-1在男性不育中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。