食源性金黃色葡萄球菌的耐藥機(jī)制及檢測方法研究進(jìn)展

韋志萍　解艷秋

【摘要】 金黃色葡萄球菌（SA）可產(chǎn)生多種毒素及多種酶類，易引起人和動物化膿感染、人食物中毒。SA可在食品加工、包裝及運(yùn)輸過程污染食品。其耐藥機(jī)制主要為不合理的使用抗生素和消毒劑。目前，SA對大環(huán)內(nèi)酯類、β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類、環(huán)脂肽、糖肽類、唑烷酮類藥物及消毒劑均有耐藥性，對食源性SA的檢測除了傳統(tǒng)的“金標(biāo)準(zhǔn)”檢測方法外，還有多種基于分子生物學(xué)和免疫學(xué)的現(xiàn)代檢測技術(shù)，這些檢測技術(shù)對食源性SA檢測各有優(yōu)缺點(diǎn)，需多種技術(shù)結(jié)合以提高其整體檢測效果。

【關(guān)鍵詞】 食源性金黃色葡萄球菌； 耐藥； 檢測方法

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.23.086 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1674-6805（2018）23-0-03

金黃色葡萄球菌（SA）是常見的化膿性感染致病菌，它可產(chǎn)生多種毒素及多種酶類，易引起人和動物化膿感染、人食物中毒[1]。SA可在食品加工、包裝及運(yùn)輸過程污染食品，其分泌的毒素對熱不敏感，即便加熱煮沸30 min仍可致病[2]。近年來，隨著抗生素大量使用，SA感染率的升高，耐藥率也隨之升高，并出現(xiàn)多重耐藥性。目前，在醫(yī)院、社區(qū)環(huán)境中均存在耐藥性強(qiáng)、毒力強(qiáng)的耐藥型SA，這給金黃色葡萄球菌感染的防治增加了難度。本文就近年來SA的耐藥機(jī)制及檢測方法進(jìn)展做一綜述。

1 耐藥機(jī)制

不合理的使用抗生素、消毒劑是SA耐藥菌株增加、多重耐藥菌出現(xiàn)的主要原因。

1.1 大環(huán)內(nèi)酯類

SA質(zhì)粒和染色體含有erm基因，這些基因是SA對大環(huán)內(nèi)酯類藥產(chǎn)生耐藥性的主要原因[3]。erm基因主要有ermA、B、C基因。大環(huán)內(nèi)酯類藥的抗菌作用是通過抑制細(xì)菌內(nèi)的核糖體23S rRNA基因活性，阻斷蛋白質(zhì)合成來實(shí)現(xiàn)的[4]。其耐藥性是因甲基轉(zhuǎn)移酶erm基因催化該基因甲基化，致使藥物與RNA親和力降低而產(chǎn)生[5]。另外，核糖體大亞基23S rRNA堿基、核糖體蛋白L4的突變均可導(dǎo)致大環(huán)內(nèi)酯類藥的耐藥性[6]。

1.2 β-內(nèi)酰胺類

SA耐藥性的產(chǎn)生是由于其存在一個mecA這一特有的耐藥基因，該基因在SA對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥方面起著重要作用。SA菌體表面存在一種青霉素結(jié)合蛋白，其在細(xì)菌生長繁殖中發(fā)揮重要作用。因青霉素結(jié)合蛋白易與β-內(nèi)酰胺類抗菌藥結(jié)合而失去活性，導(dǎo)致細(xì)胞壁合成受阻而使細(xì)胞凋亡[7]。mecA上有一可移動染色體盒SCCmec中，可編碼出新的青霉素結(jié)合蛋白。這一新的青霉素結(jié)合蛋白與β-內(nèi)酰胺類藥親和力降低，但它同樣可參與細(xì)胞壁的合成，故可替代失活的青霉素結(jié)合蛋白參與細(xì)胞壁的合成，從而產(chǎn)生耐藥性[8]。

1.3 氟喹諾酮類

氟喹諾酮類藥物對SA的作用靶位酶改變及其在菌體內(nèi)蓄積量減少是引起耐藥性的重要原因。此類藥物基本結(jié)構(gòu)為1，4-二氫-4-氧代-3-喹啉羧酸，其可抑制細(xì)菌的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶、促旋酶的活性，阻斷其遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄而使其凋亡。研究證實(shí)，除了靶酶基因位點(diǎn)突變引起靶酶空間位點(diǎn)變異外，細(xì)菌對藥物排泄增加、攝入減少引起體內(nèi)藥物蓄積減少也可導(dǎo)致細(xì)菌對氟喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性，其中以排泄增加為主，與排泄相關(guān)的基因主要有nor基因[9-10]。

1.4 環(huán)脂肽

細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能改變、基因突變和細(xì)胞壁異常改變均是SA對環(huán)脂肽耐藥的原因。環(huán)脂肽殺菌作用是通過影響細(xì)胞膜對氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，阻斷細(xì)胞壁肽聚糖磷壁酸酯質(zhì)的合成，動作細(xì)胞膜去極化來實(shí)現(xiàn)[11]。SA對環(huán)脂肽的耐藥機(jī)制為：其一，抗菌作用靶點(diǎn)基因突變，引起藥物與細(xì)菌結(jié)合點(diǎn)減少，造成藥物對SA的殺死能力減低而產(chǎn)生耐藥性；其二，參與細(xì)胞壁合成的相關(guān)基因表達(dá)升高，造成細(xì)菌細(xì)胞壁增厚，使藥物殺死細(xì)菌能力降低而產(chǎn)生耐藥性[12]。

1.5 糖肽類

SA對糖肽類藥物的耐藥性主要與細(xì)胞壁增厚、抗生素誘導(dǎo)、青霉素結(jié)合蛋白改變、調(diào)節(jié)基因改變、耐藥基因轉(zhuǎn)移、肽聚糖交聯(lián)減少等。SA細(xì)胞的細(xì)胞壁中的肽聚糖層存在D-丙氨酰-D-丙氨酰酸殘基，其一旦被萬古霉素結(jié)合，則使大多數(shù)藥物不能通過細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而使藥物殺死細(xì)胞的能力減弱而產(chǎn)生耐藥性[11]；一些糖肽類藥物作用于細(xì)胞壁會引起青霉素結(jié)合蛋白表達(dá)增加，細(xì)胞壁增厚，使藥物進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的濃度降低，從而降低了對細(xì)胞的殺傷力[13]；調(diào)節(jié)基因改變，如agr基因功能缺失等也會導(dǎo)致SA對糖肽類藥物耐藥；桂中玉等[14]報道，SA耐藥菌株中的耐藥基因可從腸球菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)移而來，故耐藥基因轉(zhuǎn)移可引起細(xì)菌耐藥，肽聚糖單體五肽上的酰胺化谷氨酸殘基數(shù)量減少引起肽聚糖交聯(lián)減少，肽聚糖單體增加，使更多的萬古霉素被結(jié)合，造成藥物與細(xì)菌靶位接觸減少；體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，萬古霉素耐藥菌株在無萬古霉素的情況下，其耐藥性降低，說明抗生素誘導(dǎo)也可引起細(xì)菌耐藥性增加[15]。

1.6 消毒劑

外排泵分子、質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因qac是SA對消毒劑耐藥的重要因素。消毒劑是通過物理和化學(xué)途徑作用于細(xì)胞外部、細(xì)胞質(zhì)等靶點(diǎn)，破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，造成胞內(nèi)物質(zhì)外滲、氧化胞內(nèi)酶等方式而產(chǎn)生殺菌作用，這種作用無選擇性。外排泵分子的介導(dǎo)的耐藥機(jī)制為，消毒劑可致細(xì)菌染色體上的norA、norC基因表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)了SA對消毒劑的抵抗能力[16]。QacR蛋白是qacA基因的負(fù)調(diào)控因子，當(dāng)其作用底物存在時，消毒劑可結(jié)合QacR蛋白，從而阻止了消毒劑與qacA基因結(jié)合，造成qacA表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了細(xì)胞消除其內(nèi)的消毒劑[17]。

1.7 唑烷酮類

SA對唑烷酮類藥物的耐藥機(jī)制與存在cfr基因、23S rRNA V 區(qū)突變有關(guān)[18]。利奈唑胺是常用的唑烷酮類藥物之一，它的殺菌作用是通過結(jié)合細(xì)菌中核糖體肽酰轉(zhuǎn)移酶活性中心，抑制蛋白質(zhì)的合成來實(shí)現(xiàn)[16]。細(xì)菌中的核糖體肽酰轉(zhuǎn)移酶活性中心主要由rRNA組成，故其上的RNA突變是SA對利奈唑胺耐藥的一個重要因素；另外，23S rRNA V 區(qū)上的G2503位點(diǎn)是cfr基因的作用靶點(diǎn)，故存在cfr 基因同樣可引起細(xì)菌耐藥[17]。

2 檢測方法

目前，對SA的檢測主要包括兩個方面：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的檢測及其產(chǎn)生毒素的檢測。傳統(tǒng)的“金標(biāo)準(zhǔn)”檢測方法是經(jīng)增菌培養(yǎng)、選擇性培養(yǎng)后進(jìn)行鑒定試驗(yàn)，如甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)、血漿凝固酶試驗(yàn)等，該方法操作簡便，費(fèi)用低，但存在檢測時間長、假陰性高、敏感度低等不足。近期，陸續(xù)出現(xiàn)一些有關(guān)快速、敏感性高的檢測SA的方法的報道，主要有分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法（抗原抗體反應(yīng)）兩類，以下對這兩類檢測方法進(jìn)行具體闡述。

2.1 分子生物學(xué)方法

與免疫學(xué)方法相比，分子生物學(xué)檢測方法對SA新產(chǎn)生的毒素、特異性基因具有明顯優(yōu)勢，常見的檢測方法有聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）技術(shù)、基因芯片。

2.1.1 PCR技術(shù) 其通過變性、退火和延伸的基本步驟進(jìn)行基因體外擴(kuò)增。mecA基因存在一種活性很低的青霉素結(jié)合蛋白，它可與β-內(nèi)酰胺類藥物結(jié)合而產(chǎn)生耐藥性。SA菌屬特異性鑒別基因16S rRNA、23S rRNA、耐熱核酸酶基因等可作為檢測靶點(diǎn)而用于SA的檢測[18]。當(dāng)傳統(tǒng)方法檢測SA陰性時，可用PCR檢測細(xì)菌內(nèi)毒素以判斷是否存在SA感染[19]。

2.1.1.1 多重PCR 普通的PCR只有一對引物，PCR擴(kuò)增出一個核酸片段，多重PCR則用≥2對引物同時擴(kuò)增多個核酸片段，既可檢測同菌種的不同靶基因，還可同時檢測不同菌種，其效率顯著高于普通PCR[20]。

2.1.1.2 Real-time熒光定量PCR 其原理是通過檢測熒光強(qiáng)度的即時變化以檢出樣品基因拷貝數(shù)，進(jìn)行無復(fù)雜擴(kuò)增產(chǎn)物后處理過程，該法極大提高了基因檢測的特異性，且耗時短、效率高，故被廣泛應(yīng)用[21]。為了進(jìn)一步提高檢出效率，一般需聯(lián)合多重PCR檢出法。有學(xué)者用Real-time熒光定量PCR及多重PCR對mecA及nuc基因進(jìn)行檢測，在2 h內(nèi)即準(zhǔn)確檢出SA及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[22]。

PCR技術(shù)雖然具有高特異性、高敏感性的優(yōu)點(diǎn)，但檢測前需增菌，需要較長的時間，目標(biāo)DNA提取易被各種因素影響；且高擴(kuò)增能力和高敏感度常引起檢測結(jié)果的假陽性，使其臨床應(yīng)用受到影響。

2.1.2 LAMP LAMP是以可識別靶序列上6個位點(diǎn)的4條引物，用有鏈置換功能的DNA聚合酶，擴(kuò)增產(chǎn)生莖環(huán)結(jié)構(gòu)，對目標(biāo)DNA大量擴(kuò)增產(chǎn)生多種片段DNA產(chǎn)物。LAMP具有高特異性的優(yōu)點(diǎn)，且檢測速度快，效率高。

2.1.3 基因芯片 是在支持物（硅片、玻片等）上固定大量針分子，可同時檢測和分析樣品中的大量序列。其最大特點(diǎn)是可同時檢測大量樣品，且可用熒光檢測大量不同的目標(biāo)基因。傳統(tǒng)的病原菌檢測手段多僅用于一種或兩種相似的細(xì)菌或毒素檢測，然而臨床上或疾病防治中，患者多伴有多種病原菌感染，這給檢測工作增加了難度。

2.2 免疫學(xué)方法

2.2.1 免疫磁珠技術(shù) 該技術(shù)是通過用高度均一的納米磁珠為固相載體，使抗體或抗原偶聯(lián)至磁珠上，它是一種免疫捕捉技術(shù)，可避免樣品中基質(zhì)的干擾，還可高效敏感檢出目標(biāo)物質(zhì)。

2.2.2 免疫生物傳感器 即集成了生物材料、仿生材料及物理化學(xué)換能器并可進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的一類儀器。換能器類型有光學(xué)、電化學(xué)、熱學(xué)、壓電等。其原理是利用抗原-抗體間的特異性結(jié)合，并把這種反應(yīng)通過物理化學(xué)換能器轉(zhuǎn)化為信息進(jìn)行傳輸。

2.2.2.1 壓電晶體型生物傳感器 是通過測定抗原-抗體特異性反應(yīng)前后壓電質(zhì)量變化而進(jìn)行信息轉(zhuǎn)化的一種傳感器。相對于ELISA，其具有操作簡單、耗時少等優(yōu)勢，但也存在檢測敏感度低的不足。

2.2.2.2 表面等離子體共振生物傳感器 通過測量抗原-抗體特異性結(jié)合前后表面等離子體波的共振吸收峰發(fā)生的改變以達(dá)到檢測目的。與傳統(tǒng)檢測方法比較，表面等離子體共振生物傳感器檢測費(fèi)用較高，其敏感度和穩(wěn)定性尚需提高。

2.2.2.3 免疫熒光生物傳感器 對待測物染色使其釋放熒光，或用熒光標(biāo)記物的抗體與待測物結(jié)合后，通過檢測其發(fā)出的熒光以達(dá)到檢測目的。由于光纖的光學(xué)性能好，傳輸損耗低，不易受電磁干擾，已有研究者將其用于SA腸毒素B的檢測。雖對SA檢測的抗原-抗體檢測體系無須提取DNA，但由于抗體的成分為蛋白質(zhì)，因此存在合成困難、不穩(wěn)定、成本高、分解率高等不足，使其應(yīng)用范圍受到了限制。

食源性SA的感染越來越普遍，主要是由于抗生素的大量使用引起的耐藥，不合理的使用抗生素、消毒劑是其耐藥主要原因。對食源性SA的檢測除了傳統(tǒng)的“金標(biāo)準(zhǔn)”檢測方法外，還有多種基于分子生物學(xué)和免疫學(xué)的現(xiàn)代檢測技術(shù)，這些檢測技術(shù)對食源性SA檢測各有優(yōu)缺點(diǎn)，需多種技術(shù)結(jié)合以提高其整體檢測效果。

參考文獻(xiàn)

[1] Prenafeta A，Sitja M，Holmes M A，et al.Short communication：Biofilm production characterization of mecA and mecC methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated from bovine milk in Great Britain[J].J D S，2014，8（8）：462-470.

[2]炊慧霞，張秀麗，廖興廣，等.河南省2010年食源性金黃色葡萄球菌和沙門菌耐藥性分析[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，40（2）：639-641.

[3]呂國平，王莧，魏秀萍，等.食源性金黃色葡萄球菌耐藥性和mecA基因分析[J].環(huán)境與健康雜志，2013，30（12）：645-646.

[4]于宏偉，郭潤芳，賈英民.食品中金黃色葡萄球菌的分布及相關(guān)毒力基因的表達(dá)研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，37（1）：89-90.

[5]馮震，蔣波，房蕊，等.食源性金黃色葡萄球菌腸毒素基因型檢測與分布研究[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2015，44（9）：3460-3467.

[6]舒高林，牛桓彩，劉國蓉，等.北京市昌平區(qū)食源性金黃色葡萄球菌藥敏分析及分子流行病學(xué)特征研究[J].疾病監(jiān)測，2015，65（9）：770-775.

[7]王偉，郭云昌，裴曉燕，等.中國食源性和豬源性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌遺傳特性和耐藥特征分析[J].衛(wèi)生研究，2013，74（6）：925-931.

[8]呂國平，秦麗云，王莧.食源性金黃色葡萄球菌青霉素類藥物耐藥基因型的分析[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2012，24（6）：529-532.

[9]陳國利，吳亞英，姜亦華，等.食源性金黃色葡萄球菌腸毒素及耐藥性分析[J].醫(yī)學(xué)動物防制，2016，62（7）：757-759.

[10]牛桓彩，舒高林，劉國蓉，等.80株食源性金黃色葡萄球菌藥敏結(jié)果分析[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2016，44（15）：2259-2261.

[11]馬伊薩蘭，余博旸，陳娟，等.食源性金黃色葡萄球菌粘附素基因的檢測及蛋白酶K和DNase Ⅰ對菌株被膜形成的影響[J].食品工業(yè)科技，2016，33（17）：185-189.

[12]周藜，周倩，朱玫.貴州省食源性金黃色葡萄球菌腸毒素及耐藥分析[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2014，55（22）：3318-3320.

[13]于宏偉，郭潤芳，賈英民.食品中金黃色葡萄球菌的分布及相關(guān)毒力基因的表達(dá)研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，99（1）：87-93.

[14]桂中玉，李琳，李冰，等，金黃色葡萄球菌耐藥性與生物被膜能力的鑒定[J].現(xiàn)代食品科技，2014，47（3）：69-75.

[15]熊元，王波，李皓宇，等.金黃色葡萄球菌小菌落突變株的分離與鑒定[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2015，67（5）：968-971.

[16]向紅，周藜，廖春，等.金黃色葡萄球菌及其引起的食物中毒的研究進(jìn)展[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2015，27（2）：196-199.

[17]賈紅巖，崔婧，王軼.金黃色葡萄球菌感染的分布特征及耐藥性分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2013，43（1）：190-192.

[18]衛(wèi)沛楠，呂國平，徐保紅，等.食源性金黃色葡萄球菌9種腸毒素基因的多重PCR檢測[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，40（17）：63-64.

[19]鄭秋月，戰(zhàn)曉微，那晗，等.食源性MRSA雙色熒光PCR檢測方法建立[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2015，45（1）：105-106.

[20]李玉鋒，何洋，劉紅露. 應(yīng)用基因芯片技術(shù)鑒定食源性金黃色葡萄球菌的研究[J].食品科學(xué)，2007（12）：294-297.

[21]李云，魏秀萍，衛(wèi)沛楠，等.多重PCR檢測食源金黃色葡萄球菌毒素基因的建立及應(yīng)用[J].河北師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2013，37（5）：514-518.

[22]姜侃，呂沁風(fēng)，汪新，等.三重LAMP法檢測食品中沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌[J].食品科學(xué)，2013，66（24）：182-187.

（收稿日期：2018-03-21）