復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方調(diào)節(jié)肝臟脂肪酸組成防治非酒精性脂肪肝＊

王露莎，寇天順，黃云翠，吳 琪，嚴(yán)詩楷，榮向路，郭 姣

（廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院廣東省代謝性疾病中西醫(yī)結(jié)合研究中心 廣州 510006）

隨著高糖、高脂肪、高熱量等不健康飲食習(xí)慣和久坐少動行為習(xí)慣的盛行，糖尿病、肥胖、高脂血癥、脂肪肝等糖脂代謝紊亂疾病發(fā)病率越來越高。糖脂代謝?。℅lucolipid Metabolic Disease，GLMD）是一種以糖、脂代謝紊亂為特征，由遺傳、環(huán)境、精神等多種因素參與的疾病，以神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、炎癥、腸道菌群失調(diào)為核心病理，以高血糖、血脂失調(diào)、非酒精性脂肪肝、超重、高血壓及動脈粥樣硬化等單一或合并出現(xiàn)為主要臨床表現(xiàn)特點[1]。其中肝臟作為糖脂代謝紊亂的主要靶器官之一，肝臟脂肪性病變會出現(xiàn)肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理特征。

復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方（FTZ）由八味藥組成，包括佛手、女貞子、杜仲、白術(shù)、三七、黃連等。其主要成分有小檗堿、巴馬汀、丹酚酸B、紅景天苷、特女貞苷、木蘭堿、迷迭香酸、非洲防己堿、表小檗堿、藥根堿、黃連堿、5，7-二甲氧基香豆素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和齊墩果酸等[2,3]。前期研究表明，F(xiàn)TZ可降低血清中TC、TG、LDL-C水平，具有改善脂肪肝、降血脂、抗動脈粥樣硬化、改善血液流變學(xué)等多重作用[4-9]。在此基礎(chǔ)上，本研究基于肝臟脂肪酸代謝分析探討FTZ對高脂飲食所致的脂代謝紊亂的影響，及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物實驗

1.1.1 動物分組與給藥方式

8周齡C57BL/6j小鼠，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，SPF級，合格證號：44007200033452。廣東藥科大學(xué)實驗動物中心SPF級飼養(yǎng)。根據(jù)小鼠體重、FPG、TC和TG等血液指標(biāo)，將小鼠隨機分為5組，分別設(shè)為正常對照組（Control）、模型組（Model）、二甲雙胍陽性對照組（Metformin）、FTZ低劑量組（FTZ-L）、FTZ高劑量組（FTZ-H）。

飼養(yǎng)溫度：20-25℃，濕度：40-70%，采用12 h：12 h晝夜間斷照明；自由進(jìn)食飲水。

干預(yù)方式：除正常對照組給予普通維持飼料外，模型組及給藥組小鼠給予高脂飼料制備非酒精性脂肪肝小鼠模型，造模同時各給藥組灌胃給予相應(yīng)藥物[4]。正常對照組、模型組給予5%阿拉伯樹膠水溶液，陽性藥二甲雙胍組給予250 mg?kg-1二甲雙胍溶液，F(xiàn)TZ低劑量組（FTZ-L）給予0.6 g?kg-1FTZ浸膏粉溶液，F(xiàn)TZ高劑量組（FTZ-H）給予1.2 g?kg-1FTZ浸膏粉溶液，以5%阿拉伯樹膠水溶液為溶劑按10 mL?kg-1灌胃給藥。

1.1.2 糖脂代謝相關(guān)血液指標(biāo)

經(jīng)乙醚麻醉，側(cè)眼底靜脈叢取血，肝素鈉抗凝，離心取血漿，測定FPG、TG、TC、LDL-C水平、游離脂肪酸（NEFA）。利用Elisa測定血中FINS水平，計算胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR值，HOMA-IR=FPG（mmol?L-1）×FINS（mIU ?L-1）/22.5[10]。

1.1.3 口服糖耐量實驗（OGTT）

小鼠禁食16 h后眼底靜脈叢取血，灌胃予20%葡萄糖溶液10 mL ?kg-1。灌胃后分別于20、60、120 min眼底靜脈叢取血，測定血糖并計算AUC。

1.1.4 體脂比

利用小動物核磁共振全身成分分析儀測定小鼠脂肪以及瘦肉成分，通過對比體重計算相應(yīng)的體脂比。

1.1.5 取材及肝臟病理學(xué)觀察

給藥16周后，經(jīng)乙醚麻醉取血后脫頸椎處死小鼠，分離肝臟，稱重后部分液氮凍存，于-80℃保存?zhèn)溆茫徊糠纸?jīng)4%多聚甲醛固定，脫水，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色；部分經(jīng)10%中性甲醛固定后，脫水，OCT包埋切片，油紅O染色。多光譜顯微鏡明場下進(jìn)行病理學(xué)觀察。

1.2 GC-MS法分析肝臟脂肪酸組分[11]

1.2.1 色譜條件

色譜柱：DB-23石英毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm×0.15μm，）；程序升溫：初溫50℃，保持0.5min，以20℃/min升至140℃，保持5 min，再以4℃/min升至240℃，保持5 min，后運行250℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度250℃，分流比10∶1，進(jìn)樣量1.0μL；載氣為高純氦氣，流速1mL/min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電離方式：EI離子源；離子源溫度230℃；電子能量：70 eV；四極桿溫度150℃；溶劑延遲時間4.5 min；掃描范圍m/z40～500 amu；選擇離子掃描方式（掃描）。

1.2.3 供試品溶液的制備

取50 mg解凍后的小鼠肝臟組織，加入600μLCHCL3-MeOH（2∶1，v/v），勻漿（1 800 rpm，30 s）；加入200μL超純水渦旋30 s，室溫下離心分離（10 000 rpm，5 min）；取100μL的下層萃取液，室溫下N2吹干；加入200μLCHCL3-MeOH（2∶1，v/v）復(fù)溶，加入40μL衍生化試劑混勻，靜置1 h。移取上清液到內(nèi)襯管中，供GC-MS分析。

1.3 儀器

小動物核磁共振全身成分分析儀（LF90II，Bruker），Vectra3.0定量病理成像系統(tǒng)（CLS142568，PerkinElmer）氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent7890B-5977B）；SC-3610低速離心機（Zonkia，中國）；D3024R型臺式高速冷凍離心機（SCILOGEX，美國）；GENIUS3型漩渦混合器（IKA，德國）；HGC-24A型氮吹儀；BT125D型十萬分之一分析天平（賽多利斯，德國）

1.4 試劑

D12451高脂飼料、D12450-B普通維持飼料（廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心），甘油三酯測定試劑盒、葡萄糖測定試劑盒、總膽固醇測定試劑盒（上海榮盛生物藥業(yè)有限公司），insulin Elisa試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)品：Supelco 37 Component FAME Mix（Sigma-Aldrich，CRM47885）；

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±SD)統(tǒng)計。采用IBM SPSS Statistics19版統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05顯示具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 糖脂代謝相關(guān)指標(biāo)比較

給予高脂飼料16周，與正常對照組比較，模型組小鼠血漿中的FPG、TC、TG、LDL-C含量均明顯上升；檢測其血漿中的NEFA，模型組的NEFA含量比正常對照組明顯升高。模型組小鼠FINS對比正常對照組含量增多，計算其HOMA-IR值，結(jié)果顯示模型組的HOMA-IR平均值達(dá)到3.5。通過OGTT，發(fā)現(xiàn)模型組的糖耐量較于正常對照組明顯減弱。提示長期高脂飲食的模型組小鼠有胰島素抵抗、高血糖、高脂血癥等病理特征。給予FTZ干預(yù)16周后，與模型組比較，F(xiàn)TZ高、低劑量組的FPG、TC、TG、LDL-C、NEFA均有不同程度的降低（圖1，3），且有統(tǒng)計學(xué)意義。并且體內(nèi)的FINS也有明顯的下降，其HOMA-IR值亦明顯降低（圖2）。在OGTT實驗中，F(xiàn)TZ高、低劑量給藥組的糖耐量則有明顯好轉(zhuǎn)（圖2）。統(tǒng)計其AUC發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，F(xiàn)TZ高低劑量給藥組OGTT實驗的AUC明顯減少。提示FTZ可以改善非酒精性脂肪肝模型小鼠的糖耐量。以上實驗結(jié)果說明FTZ可以改善高脂飲食導(dǎo)致的脂代謝紊亂小鼠的高血糖、高血脂與胰島素抵抗。

通過時域核磁共振（TD-NMR）技術(shù)無創(chuàng)檢測小鼠體內(nèi)脂肪含量，瘦肉含量（圖3）。實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過16周高脂飼料喂養(yǎng)的模型組體內(nèi)的脂肪含量明顯升高（P＜0.01），而瘦肉含量無明顯差異，其體脂率（fat/lean值）明顯上升（P＜0.01），提示模型組小鼠體內(nèi)脂肪蓄積過多。給藥16周后，F(xiàn)TZ可以有效降低肥胖小鼠體內(nèi)的脂肪含量和體脂率，并且維持體內(nèi)的瘦肉含量無明顯變化，提示FTZ可以有效改善脂代謝紊亂。

2.2 肝臟病理結(jié)果比較

給藥10周后，HE染色觀察，高脂飼料喂養(yǎng)的模型組小鼠可見大量不同程度的脂肪變性和肝細(xì)胞空泡變性，匯管區(qū)周圍部分的組織最為明顯。FTZ高、低劑量組與模型組相比，脂肪變性程度及肝細(xì)胞空泡癥狀減輕，胞內(nèi)脂滴數(shù)量減少，體積變?。▓D4）。

為確認(rèn)肝臟內(nèi)脂質(zhì)沉積的情況，進(jìn)行油紅O染色，油紅O可以特異性使脂滴染成紅色。實驗結(jié)果顯示，正常對照組小鼠的肝臟組織僅有少量細(xì)小脂滴，而模型組的肝細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴，具有肝臟脂肪性病變的表型；給藥FTZ高劑量組和低劑量組的肝組織脂滴的大小和數(shù)量對比模型組均有不同程度的減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 肝臟脂肪酸組分分析

圖1 FTZ可以改善HFD所致的脂代謝紊亂小鼠血循環(huán)糖脂代謝指標(biāo)A-D.血漿中FPG、TC、TG、LDL-C濃度

圖2 FTZ可以改善HFD所致的脂代謝紊亂小鼠的胰島素抵抗A.血漿中FINS濃度B.各組小鼠的HOMA-IR值C-D.OGTT實驗各時間點血糖濃度及AUC值

圖3 FTZ可以改善HFD所致的脂代謝紊亂小鼠的脂代謝A.血漿中NEFA濃度B-D.各組小鼠體內(nèi)脂肪、瘦肉含量及體脂率（fat/lean）

圖4 FTZ減少肝臟的脂滴沉積A.肝臟HE染色（200×）B.肝臟油紅O染色（200×）

通過GC-MS對小鼠肝臟脂肪酸的分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組小鼠肝中的總脂肪酸（TFA）含量明顯升高（表1），其中C15∶0、C16∶0、C17∶0、C18∶0等飽和脂肪酸絕對含量顯著升高（P＜0.01），而給藥高、低劑量組的C15∶0、C16∶0、C17∶0、C18∶0絕對含量明顯降低，說明FTZ可以有效降低肥胖小鼠肝臟的飽和脂肪酸含量。該模型小鼠肝臟中大約35%的脂肪酸是單不飽和脂肪酸（Mono-Unsaturated Fatty Acids，MUFA），主要是C18∶1N9C。模型組的C16∶1、C18∶1N9C這2種MUFA含量與其占總脂肪酸的比值均明顯升高，給藥FTZ之后，其比值明顯下降，趨于正常對照組。這些脂肪酸含量變化的差異可能是肝臟甘油三酯代謝和膽固醇代謝變化的結(jié)果。其中，模型組的C14∶1、C15∶1、C17∶1、C18∶1N9T、C20∶1、C24∶1、C22∶1 等 MUFA/TFA比值顯著降低，給予FTZ干預(yù)16周后，其含量明顯上升。與正常對照組相比，模型組的PUFA/TFA值明顯下降，而給藥FTZ高、低劑量組的PUFA/TFA值則明顯回升（表2）。其中C20∶2、C22∶2、C18∶2N6T、C20∶3N6、C20∶4N6、C22∶6N3等PUFA/TFA值均有不同程度的升高且有統(tǒng)計學(xué)意義，提示FTZ改善脂代謝與升高肝臟PUFA的比重密切相關(guān)。

另外，C8∶0、C10∶0、C11∶0、C13∶0僅在少部分小鼠肝臟樣本中有檢測到，此部分不計入統(tǒng)計。

以上脂肪酸組分分析提示，F(xiàn)TZ可以降低高脂飲食導(dǎo)致的糖脂代謝紊亂模型小鼠肝臟中的飽和脂肪酸同時升高肝臟中不飽和脂肪酸，調(diào)節(jié)機體的甘油三酯代謝和膽固醇代謝，從而改善胰島素抵抗、高血糖、高脂血癥。

3 討論

肝臟是脂質(zhì)合成和利用的重要場所，也是胰島素抵抗的重要靶器官之一。肝細(xì)胞脂肪性病變的主要機制是由于脂肪組織的脂質(zhì)分解加速，使血循環(huán)中的NEFA增加，導(dǎo)致NEFA在肝臟中的沉積[12]。肝臟脂肪酸含量增多是糖脂代謝紊亂的重要危險因素，這主要是由于NEFA在肝細(xì)胞內(nèi)沉積后轉(zhuǎn)化為TG、神經(jīng)酰胺等，其中TG以極低密度脂蛋白（very-low-density lipoprotein，VLDL）的形式從肝臟輸出進(jìn)入血循環(huán)，影響心血管系統(tǒng)，容易引起其他糖脂代謝疾病并發(fā)癥[13]。不同類型的脂肪酸有著不同的功能，如在肝臟脂肪性病變過程中，具有促炎效應(yīng)的花生四烯酸（C20∶4）增多，嚴(yán)重時會使肝臟發(fā)生炎癥病變，也是機體脂代謝紊亂后會出現(xiàn)慢性炎癥的原因之一[14]；C14∶0可使肝臟脂肪酸合成增加，導(dǎo)致血脂升高；C18∶0含量過高會損害血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，與動脈粥樣硬化的發(fā)生相關(guān)[15]；C16∶0可與血液中游離的鐵離子結(jié)合使肝細(xì)胞內(nèi)的鐵過載，導(dǎo)致活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）生產(chǎn)過量和脂質(zhì)過氧化，破壞機體肝臟脂代謝平衡，導(dǎo)致胰島素抵抗[16]；C20∶3n-6、C20∶4n-6為前列腺素E1（Prostaglandin E1，PGE1）的合成前體[17]。

表1 給藥16周后小鼠肝臟各脂肪酸組分含量（μg?mg-1）

本研究主要是觀察FTZ對高脂飲食導(dǎo)致的脂代謝紊亂小鼠肝臟脂肪酸的代謝變化的影響。當(dāng)肝細(xì)胞過度積累膽固醇時，將會通過激活C-Jun N端激酶1（c-Jun N-terminal kinase 1，JNK1）通路使細(xì)胞線粒體受損，導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡與壞死[18]。而FTZ可以降低血漿中的TC與LDL-C，減少膽固醇在肝臟積聚，降低肝損傷的發(fā)生，使肝臟保持良好的脂代謝功能。高熱量飲食時肝臟內(nèi)SFA含量的升高對肝細(xì)胞有直接的毒性作用，SFA在肝細(xì)胞內(nèi)過量沉積，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和過氧化物酶體途徑使氧化增加，使ROS生成增多，若超出肝臟產(chǎn)生的抗氧化物的能力，則可引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[19]。模型組小鼠肝臟中SFA含量的增加，一方面與長期攝入高脂飼料有關(guān)，另一方面與機體的內(nèi)分泌和代謝紊亂相關(guān)。高脂飼料可使血液中的NEFA濃度增加，使脂肪組織對胰島素的敏感性下降，減弱胰島素對脂肪

分解的抑制作用，使脂肪組織中TG分解為SFA增加。循環(huán)血中的SFA可通過調(diào)節(jié)主動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)二酯酰甘油?；D(zhuǎn)移酶2（Diglyceride acyltransferase，DGAT2）和蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）的活性影響TG的合成，從而加速動脈粥樣硬化的形成[20]。前期研究顯示有FTZ抗動脈粥樣硬化的作用，其機制可能是與通過降低肝臟中的SFA含量，減少進(jìn)入血循環(huán)血漿中的SFA，使SFA在主動脈平滑肌細(xì)胞沉積的風(fēng)險減弱相關(guān)。

表2 給藥16周后小鼠肝臟各脂肪酸占總脂肪酸的百分比（%of total）

不同的脂肪酸對機體脂代謝有不同的影響，F(xiàn)TZ可以降低肝臟中的SFA含量，并且升高M(jìn)UFA、PUFA在TFA中的比重，逆轉(zhuǎn)脂質(zhì)異位沉積于肝臟的脂毒性（圖5）。研究發(fā)現(xiàn)，無論是外源性給予還是內(nèi)源性合成PUFA均能改善肝臟脂肪沉積狀態(tài)。肝臟內(nèi)源性合成的PUFA能夠激活PPARα上調(diào)參與肝臟脂肪酸氧化的基因轉(zhuǎn)錄，抑制膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（Sterol-Regulatory Element Binding Protein 1c，SREBP-1c），下調(diào)參與肝臟脂肪合成的基因表達(dá)[13]。當(dāng)PUFA減少時，可誘導(dǎo)SREBP-1c表達(dá)，以及增加其下游甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶1（Glycerol-3-Phosphate Acyltransferase 1，GPAT1）的表達(dá)，從而使VLDL的分泌增加，加重高甘油三酯血癥[21]。而FTZ可以明顯升高肝臟的PUFA，提示FTZ改善高甘油三酯血癥的作用可能與下調(diào)SREBP-1c和GPAT1的mRNA表達(dá)，減少VLDL的分泌通路相關(guān)。在體內(nèi)研究中，F(xiàn)TZ可下調(diào)大鼠肝組織中肝X受體（Liver X Receptor，LXR）和SREBP-1cmRNA的表達(dá)以降低非酒精性脂肪肝大鼠血循環(huán)中的TG、NEFA，具有調(diào)脂保肝作用。FTZ可使NAFLD小鼠血漿及肝組織中TC、TG含量均顯著降低，下調(diào)肝臟中的SREBP-1c的mRNA表達(dá)量[22]，并且上調(diào)肝臟PPARα及其下游基因肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1（Carnitine Palmitoyl Transferase 1，CPT1）的Mrna表達(dá)量[4]。Yoshikawa 等研究發(fā)現(xiàn)，PUFA通過抑制LXR及SREBP-1c表達(dá)調(diào)控脂質(zhì)生成過程[23]，提示FTZ可能是通過增加肝臟內(nèi)PUFA含量改善體內(nèi)的脂代謝。在體外研究中，F(xiàn)TZ可降低Hepg2細(xì)胞胰島素抵抗模型上清液中葡萄糖含量，下調(diào)核因子活化B細(xì)胞Κ輕鏈增強子（Nuclear Factor Kappa-Light-Chain-Enhancer Of Activated B Cells，NFΚB）、腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）、白介素6（Interleukin-6IL-6）的蛋白表達(dá)，上調(diào)磷酸肌醇3激酶（Phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、胰島素受體底物1（Insulin Receptor Substrate 1，IRS1）和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（Glucose Transporter Type 4，GLUT4）的蛋白表達(dá)[24,25]。已有研究表明C20∶5n-3具有抑制白介素1β（IL-1β）、TNF-α和IL-6等促炎性炎癥因子的作用[26]。Cheng等發(fā)現(xiàn)中樞細(xì)胞暴露于C20∶4中可引起瘦素抵抗，并伴PI3K相關(guān)信號傳導(dǎo)缺陷[27]；Gonzalez-Periz等發(fā)現(xiàn)膳食攝入N-3 PUFA可以通過參與葡萄糖轉(zhuǎn)運（GLUT-4），胰島素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（IRS-1）增加肝臟的胰島素敏感性并且減輕肝臟脂肪變性[28]；提示FTZ改善肝臟的代謝功能可能與調(diào)控C20∶5n-3、C20∶4、N-3 PUFA等脂肪酸相關(guān)。FTZ除了可能通過調(diào)控不飽和脂肪酸代謝機制或者是通過調(diào)節(jié)不飽和脂肪酸的內(nèi)源性生成機制，亦有可能是通過調(diào)節(jié)腸道菌群改變脂肪酸代謝等機制，F(xiàn)TZ調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪酸代謝的具體機制還需要進(jìn)一步探討。

圖5 FTZ通過調(diào)節(jié)脂肪酸組成改善肝臟脂代謝的潛在機制

中醫(yī)藥防治糖脂代謝病有著悠久的歷史，大量的實驗研究表明，有相當(dāng)數(shù)量的中藥及天然藥物具有改善胰島素抵抗、降血糖、降血脂、抗非酒精性脂肪肝等作用。中醫(yī)藥干預(yù)糖脂代謝紊亂具有多途徑、多靶點、毒副作用小的作用特點?，F(xiàn)代中醫(yī)家多認(rèn)為糖脂代謝紊亂的關(guān)鍵病機在于脾的分清泌濁功能失調(diào)和腎的氣化功能失職，治療上多從“脾”、“腎”論治[29-31]。FTZ作為郭姣教授基于“調(diào)肝啟樞化濁”理論臨床治療糖脂代謝病的代表方，具有改善糖脂代謝紊亂、抗非酒精性脂肪肝、治療高脂血癥等臨床藥效。本研究主要是通過GC-MS檢測肝臟脂肪酸組分，更精準(zhǔn)地探索各類型的不同脂肪酸對機體的影響，并且給中醫(yī)藥復(fù)方方劑精準(zhǔn)評價提供有效的依據(jù)。肝臟脂肪酸代謝作為肥胖、2型糖尿病、高脂血癥、及動脈粥樣硬化等糖脂代謝紊亂疾病發(fā)生與發(fā)展的重要機制之一，也是干預(yù)治療糖脂代謝病的關(guān)鍵途徑之一。本實驗結(jié)果表明，F(xiàn)TZ可明顯改善高脂飲食導(dǎo)致的脂代謝紊亂小鼠肝臟的脂肪酸代謝，其機制可能與降低其肝臟中的飽和脂肪酸、升高肝臟中的多不飽和脂肪酸相關(guān)，為進(jìn)一步精準(zhǔn)闡明FTZ調(diào)控體內(nèi)脂肪酸代謝的作用機制提供基礎(chǔ)依據(jù)。