滋補脾陰方藥對脾陰虛大鼠空腸葡萄糖轉運蛋白1、葡萄糖轉運蛋白5表達的影響＊

孫曉霞，戰(zhàn)麗彬＊＊，侯圣林，江玉翠，楊關林

（1.南京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，中醫(yī)脾藏象現(xiàn)代研究實驗室 南京 210023；2.遼寧中醫(yī)藥大學 沈陽 110032）

“脾主運化”為“后天之本”的物質基礎，是指將飲食水谷消化、吸收并將其中之精微轉輸至周身的過程。這一過程伴隨著能量不斷的生成與消耗，實現(xiàn)對物質與能量代謝的調控[1]。糖類作為一種精微物質，能夠為機體提供所需能量，保障生命活動的順利進行[2]。糖類在小腸的吸收是運化精微的重要表現(xiàn)形式之一[3]。葡萄糖轉運蛋白（glucose transporters，GLUTs）作為一種跨膜運載體，是以易化擴散方式介導糖代謝的關鍵性物質[4]。臨床上脾虛證患者出現(xiàn)脾失健運的表現(xiàn)與消化系統(tǒng)營養(yǎng)吸收功能障礙有關，同時存在腸道黏膜上GLUTs的異常，提示機體對精微物質的吸收功能依賴于GLUTs[5]。本研究以脾陰虛大鼠模型為研究對象，基于“脾主運化”理論，探討脾陰虛大鼠空腸GLUT1和GLUT5表達的變化及滋補脾陰方藥（ZBPYR）的干預作用，為進一步豐富“脾主運化”的科學內涵提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性Wistar大鼠20只，體質量200±20 g。購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號：SCXK（京）2016-0011]。SPF級環(huán)境飼養(yǎng)，溫度22±3℃。

1.2 主要試劑與藥物

RIPA裂解液（碧云天，P0013B）;SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液5×（碧云天，P00015L）；蛋白Marker（Thermo，26617）；Anti-Glucose Transporter GLUT1 抗體（Abcam，ab652）；Anti-Glucose Transporter 5 GLUT5抗體（Abcam，ab41533）；β-actin Mouse mAb（CST）；羊抗小鼠IG-HRP（博士德）；羊抗兔IG-HRP（博士德）；ECL發(fā)光液（天能，180-5001）；康為世紀RNA pure Tissue&Cell Kit試劑盒（CWO584S）；諾維贊vazyme AceQ qPCR SYBR?Green Master Mix（High Rox Premixed）試劑盒。

傷陰藥（吳茱萸、制附子、肉桂，混合比例為1∶1∶1），購于南京中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂門診部。滋補脾陰方藥（紅參30 g，山藥15 g，茯苓15 g等），購于大連醫(yī)藥集團藥材公司。常規(guī)水煎，傷陰藥生藥濃度1 g/mL，滋補脾陰方藥生藥濃度3.29 g/mL，過濾后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要儀器

精密天平（奧豪斯，美國）；R-300型旋轉蒸發(fā)儀（步琪，瑞士）；小型垂直電泳槽（Bio-Rad，美國）；NanoDrop One超微量分光光度計（Thermo，美國）；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）；高速分散均質機（KAT10 basic，德國）；Real-time PCR儀（ABI 7500，美國）；小型冷凍臺式離心機（Thermo Micro CL 17R，美國）。

1.4 分組、模型建立及給藥方法

適應性喂養(yǎng)3天后，雙盲隨機分為正常組6只，脾陰虛模型組14只。采用經典復合因素方法，以饑飽失常與過勞結合燥熱耗傷陰液法建立脾陰虛動物模型，分為脾氣虛和脾陰虛兩個階段[6-7]。第1-14天為脾氣虛造模階段：飽食1日+禁食2日，3日為1個循環(huán)。期間自由飲水。每日游泳至力竭，游泳桶內徑25 cm，水深35 cm，水溫22℃。第15-24天為脾陰虛造模階段：第15天，將符合脾氣虛標準的模型納入脾陰虛造模階段。實驗過程中大鼠死亡1只，排除不符合脾氣虛標準大鼠1只。將剩余12只大鼠納入脾陰虛造模階段。模型組在脾氣虛證基礎上，每日增加傷陰藥灌胃（1 ml/100 g/只）。其余予以等體積的生理鹽水灌胃。第25-38天為滋補脾陰方藥給藥階段：將脾陰虛模型組分為脾陰虛組（6只）和滋補脾陰方藥組（6只），滋補脾陰方藥組按照1 ml/100 g/只/天胃飼ZBPYR，余組予以等體積生理鹽水胃飼。

1.5 模型評價

參考《中醫(yī)虛證辨證參考標準》及《中醫(yī)新藥臨床研究指導原則》[8-9]，綜合擬定脾氣虛證評定標準：①食少；②神疲乏力；③消瘦；④毛色枯槁無光澤，便軟或溏。脾陰虛證評定標準：①體質量下降，消瘦；②易激惹，咬斗；③肛溫升高；糞便干燥；④背毛枯稿無光澤；⑤飲食量時增時減；⑥飲水量增多；⑦游泳耐力下降。

表1 qPCR法檢測空腸GLUT1和GLUT5 mRNA表達

表2 脾氣虛造模階段各組大鼠體質量、肛溫情況（xˉ±s）

1.6 qPCR法檢測空腸GLUT1和GLUT5 mRNA表達

提取各組大鼠近端空腸組織總的RNA，按照康為世紀RNA pure Tissue&Cell Kit試劑盒說明書提示進行實驗操作并檢測RNA純度。逆轉錄的反應條件：37℃ 15 min，85°C 5 s，4℃保存。合成cDNA模板后采用SYBR Green I相對定量分析。引物由南京金斯瑞生物科技公司合成，具體引物序列詳見表1。qPCR反應條件：95℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s 40 個循環(huán)；95℃15 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s終止反應。

1.7 Western Blot法檢測空腸GLUT1與GLUT5蛋白表達

取大鼠近端空腸組織提取總蛋白，使用超微量分光光度計測定蛋白濃度并計算蛋白上樣量。將蛋白樣品分別加入10%和5%的凝膠中電泳，轉膜，5%脫脂牛奶于室溫條件下?lián)u床封閉2 h，按照1∶1 000加入一抗，4℃孵育過夜。第2日1×TBST充分洗膜（5 min×3），加入二抗（1∶2 000），1×TBST充分洗膜（5 min×3），ECL發(fā)光顯影。

1.8 統(tǒng)計學方法

所有計量資料使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，以均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示。兩組間比較行T檢驗統(tǒng)計學分析方法，多組間比較行單因素方差統(tǒng)計學分析方法，P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各階段大鼠體質量和肛溫變化比較

脾氣虛造模階段（表2）：與正常組比較，脾氣虛組大鼠體質量和肛溫明顯降低（P＜0.001）。脾陰虛造模階段（見表3）：與正常組比較，脾陰虛組大鼠體質 量顯著降低（P＜0.001）；肛溫較正常組顯著降低（P＜0.001），但較脾氣虛造模階段肛溫呈上升趨勢。滋補脾陰給藥階段（見表4）：與正常組比較，脾陰虛組和滋補脾陰方藥組大鼠體質量明顯下降（P＜0.001）；相比于脾陰虛組，滋補脾陰方藥組大鼠體質量呈增長趨勢，但無統(tǒng)計學意義。肛溫無顯著性差異。

表3 脾陰虛造模階段各組大鼠體質量、肛溫情況

表3 脾陰虛造模階段各組大鼠體質量、肛溫情況

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

組別正常組脾陰虛組n 6 1 2體質量/g 334.73±11.11 252.44±29.03***肛溫/℃34.73±0.20 34.09±0.32***

表4 滋補脾陰給藥階段各組大鼠體質量、肛溫情況

表4 滋補脾陰給藥階段各組大鼠體質量、肛溫情況

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

組別正常組脾陰虛組滋補脾陰方藥組n 6 6 6體質量/g 372.17±12.76 326.362±22.38***339.01±28.83***肛溫/℃35.07±0.12 35.03±0.20 35.01±0.21

表5 各組大鼠空腸組織GLUT1、GLUT5 mRNA表達比較

組別正常組脾陰虛組滋補脾陰方藥組GLUT1 mRNA 1.00±0.00 0.71±0.12*1.54±0.22*##GLUT5 mRNA 1.00±0.00 0.33±0.33*1.03±0.47##

2.2 模型評價

大鼠生物學特征評估：正常組大鼠反應敏捷，活動迅速，毛發(fā)光澤，眼神靈活，大便正常；脾陰虛組大鼠體重下降，易激惹、咬斗，背毛枯槁無光澤，肛溫呈升高趨勢，糞便干燥，進食量時增時減，飲水量增多。綜上，實驗結果基本符合脾陰虛動物模型評估標準。

2.3 大鼠空腸組織GLUT1、GLUT5 mRNA含量的表達

結果表明（表5、圖1），與正常組相比，脾陰虛組GLUT1、GLUT5 mRNA表達量降低（P＜0.05），滋補脾陰方藥組GLUT1 mRNA的表達含量增加（P＜0.05）；與脾陰虛組相比，滋補脾陰方藥組GLUT1 mRNA和GLUT5 mRNA的表達含量均明顯增加（P＜0.01）。

2.4 大鼠空腸組織GLUT1、GLUT5蛋白含量的表達

圖1 大鼠空腸組織GLUT1和GLUT5mRNA表達比較

圖2 大鼠空腸組織GLUT1和GLUT5蛋白表達比較

結果表明（圖2），與正常組相比，脾陰虛組GLUT1、GLUT5蛋白表達均降低（P＜0.05）；與脾陰虛組相比，滋補脾陰方藥組GLUT1、GLUT5蛋白表達均升高（P＜0.05）。

3 討論

精微物質在“脾主運化”作用下得以轉輸至全身，是營養(yǎng)物質的主要來源以及維持正常生命活動的重要保證[10-11]。脾陰是具有滋潤五臟六腑、濡養(yǎng)全身及補益腦髓等功能的精微物質，由水谷精微所化，泛指營血、津液、脂膏等一切陰液?！捌⒅鬟\化”不僅依賴于脾氣、脾陽，同時也依賴于脾陰所發(fā)揮的生理作用。脾臟病變多以虛證為主，脾陰虛是脾虛證之一?！夺t(yī)學衷中參西錄·例言》曰：“脾為太陰，乃三陰之長”，故傷陰者，脾陰首當其沖。脾陰虛證的病因病機與臟腑陰陽的偏盛偏衰及氣血津液的相互轉化相關，凡飲食失調、憂思勞倦、五臟虛損以及妄投醫(yī)藥等原因引起的陰陽氣血虧虛,皆可導致脾陰的功能障礙[12]。其中，妄用大辛大熱之劑可致脾陰受劫，是導致脾陰虛證的重要因素之一。正如《明醫(yī)雜著》言：“所用之藥，又有辛溫燥熱助火消陰之劑，遂致胃火益旺，脾陰愈傷”。脾陰虛證的病機實質為脾的“氣陰兩虛”[13]。因此，本實驗基于“飲食失節(jié)，脾胃乃傷”、“勞倦傷脾”以及“勞則氣耗”等中醫(yī)基礎理論，采用經典復合因素造模方法，在建立脾氣虛動物模型的基礎上，予以辛溫燥熱耗傷陰液之劑，成功復制了脾陰虛大鼠模型。

脾陰不足則影響機體納運水谷以及化生精微的過程，導致營養(yǎng)物質吸收障礙、物質轉換與能量代謝的異常[14]。糖類是為生命體提供能量的主要物質來源[15]。在GLUTs的協(xié)助下，葡萄糖以易化擴散的方式進出細胞膜，是糖代謝順利進行并保障能量供應的重要前提[16]。GLUT1是目前研究發(fā)現(xiàn)在體內分布最為廣泛的基礎性葡萄糖轉運體，不具有組織特異性。有研究表明，脾虛大鼠空腸上皮細胞GLUT1表達顯著降低，艾灸通過上調GLUT1表達促進物質跨膜轉運[17]。呂林等[18]通過研究脾虛型功能性消化不良大鼠發(fā)現(xiàn)其小腸GLUT1表達減少，這一結果提示我們可以從一個新的角度探索脾虛證的本質。此外，GLUT5也能夠明顯影響小腸對單糖的吸收[19]。GLUT5是果糖轉運載體，主要表達位點是小腸上皮細胞膜頂端，利用底物順濃度差轉運入小腸上皮細胞[20]。正常飲食攝入的果糖主要在小腸中被處理掉[21]。攝入果糖過量會影響人體的健康狀況，導致如肥胖、胰島素抵抗及高血壓等疾病的發(fā)生[22]。研究顯示大鼠在饑餓條件下空腸GLUT5表達含量減少，而經高糖喂食后表達明顯增加，這一研究結果說明了GLUT5對空腸的單糖吸收具有重要意義[23]。

通過觀察脾陰虛大鼠模型發(fā)現(xiàn)：空腸GLUT1、GLUT5 mRNA和蛋白表達均顯著降低，這與在脾氣虛和脾陽虛大鼠模型中表達水平降低的結果相一致[24-25]。本研究立足于脾陰虛證，在脾氣虛證、脾陽虛證的基礎上完善了對脾虛證的研究，說明在脾虛狀態(tài)下，空腸GLUT1、GLUT5 mRNA和蛋白表達含量均有不同程度下調。本實驗結果提示GLUT1、GLUT5可能參與脾陰虛狀態(tài)下糖代謝紊亂的病理過程。脾陰虛狀態(tài)下空腸GLUT1、GLUT5基因與蛋白表達的降低，可能是小腸對單糖吸收減少，進而導致機體能量代謝發(fā)生障礙的重要機制之一，進一步豐富了脾虛證科學內涵。

中醫(yī)論治脾陰虛證一直以滋養(yǎng)脾陰為根本大法[26]。正如張錫純所言：“脾陰虛者，當以滋脾陰為主，脾陰足自能灌溉諸臟腑”[27]。ZBPYR是戰(zhàn)麗彬教授結合多年臨床實踐經驗，根據(jù)清代吳澄《不居集》中資成湯化裁而成。在本研究中，ZBPYR給藥后GLUT1、GLUT 5的mRNA和蛋白表達含量較脾陰虛組均顯著提高，提示ZBPYR在轉錄和翻譯水平增加了GLUT1、GLUT5合成，通過上調其表達水平，改善脾陰虛大鼠糖代謝紊亂的異常狀態(tài)。

綜上，ZBPYR通過上調脾陰虛大鼠空腸GLUT1、GLUT5 mRNA和蛋白表達，可能是其發(fā)揮對脾陰虛證干預作用的機制之一。ZBPYR具有滋補脾陰，健脾益氣之效，對改善葡萄糖代謝紊亂具有重要意義，為臨床治療脾陰虛證及理論研究提供了新思路。但能量代謝過程復雜，涉及多靶點多途徑調控，本次研究僅從葡萄糖在體內的轉運載體入手，故對脾陰虛與能量代謝的關聯(lián)途徑與作用機制等仍需深入探索。此外，ZBPYR對脾陰虛證干預后，是否能夠調節(jié)除糖代謝之外的影響機體能量代謝的異常變化，有待進一步實驗研究。