近紅外無損檢測安胎丸中關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分的含量＊

馬晉芳，王雪利，肖 雪，彭 銀，葛發(fā)歡＊＊

（1.中山大學(xué)藥學(xué)院 廣州 510006；2.中山大學(xué)南沙研究院 廣州 511458；3.廣東藥科大學(xué) 廣州510006；4.廣東省中藥超臨界流體萃取工程技術(shù)研究中心 廣州 510006）

中藥市場中，當(dāng)進(jìn)行藥品抽樣檢驗(yàn)時(shí)，只是從大量樣品中隨機(jī)抽取少量樣品進(jìn)行質(zhì)量檢測，并不能代表產(chǎn)品的整體質(zhì)量，且檢驗(yàn)方法復(fù)雜，耗時(shí)費(fèi)力，便利性較差。如安胎丸，是古代經(jīng)典方劑，由當(dāng)歸、制川芎、黃芩、炒白芍、白術(shù)打粉加工制成的中藥復(fù)方制劑，具有安胎功效，用于妊娠血虛、胎動(dòng)不安、面色淡黃、不思飲食、神疲乏力等病癥[1]。每盒裝為10丸，每丸6 g。當(dāng)前安胎丸的檢驗(yàn)，是依照《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)?中藥成方制劑》進(jìn)行性狀、顯微鑒別、薄層鑒別以及丸劑的各項(xiàng)規(guī)定檢查[2]。在目前的文獻(xiàn)報(bào)道中，僅通過指紋圖譜[1]及1-3個(gè)指標(biāo)性成分的定量[3-6]評(píng)價(jià)安胎丸的質(zhì)量。檢測指標(biāo)少，不能涵蓋組方藥材，且檢測手段需要進(jìn)行繁瑣的前處理，有必要開發(fā)一種快速、簡便、無損的檢測方法。

近紅外光譜法是一種利用化學(xué)物質(zhì)在近紅外譜區(qū)內(nèi)的光學(xué)特性快速測定物質(zhì)化學(xué)組分含量的光譜技術(shù)[7-8]。其特點(diǎn)是吸收系數(shù)較低、無損、快速、無污染，可以直接對(duì)樣品進(jìn)行測定，不需要對(duì)樣品處理或僅需簡單處理[9]。本研究中，采用近紅外漫反射光譜無損檢測的方法，即光投向安胎丸后，在丸劑內(nèi)部發(fā)生方向不定的反射[10]，直接對(duì)其進(jìn)行檢測。待近紅外漫反射光譜穿透至一定深度的蜜丸時(shí)，獲得更加完整的安胎丸整體信息，再結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，對(duì)多批安胎丸中的每一丸進(jìn)行關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分的定量研究，建立一種抽樣檢驗(yàn)過程中更具有代表性的近紅外快速無損檢測安胎丸關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分含量的方法。

1 材料和方法

1.1 儀器和藥材

UltiMate 3000高效液相色譜儀（美國Thermo公司）；十萬分之一分析天平（XS205 DuaLRange型，梅特勒-托利多）；紫外分光光度計(jì)（UV-2600，島津（中國）有限公司）；近紅外光譜儀（SupNIR1500，聚光科技（杭州）有限公司）；化學(xué)計(jì)量學(xué)分析系統(tǒng)（THUNIR V3.0，清華大學(xué)），在線監(jiān)測分析系統(tǒng)（THU NIR Online，清華大學(xué)）；阿魏酸（純度99.00%）、黃芩苷（純度93.50%）、漢黃芩苷（純度98.80%）、黃芩素（純度98.50%）、漢黃芩素（純度98.0%）和洋川芎內(nèi)酯A（純度98.0%），均購自于中國食品藥品研究院。乙腈（色譜級(jí)，購于德國默克公司），甲酸（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）、甲醇及其它試劑均為分析純。安胎丸（批號(hào)為：151101、151002、130701、151001、130602、130501、131101、131201、140401、140402、130601、140404，江西保利制藥有限公司）。

1.2 關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分實(shí)際值的測定方法[11]

1.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取各標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，加適量甲醇溶解配制成混合標(biāo)準(zhǔn)品母液，并稀釋至如下濃度：阿魏酸0.00306 mg?mL-1、黃芩苷0.10250 mg?mL-1、漢黃芩苷0.01840 mg ?mL-1、黃芩素 0.064 mg ?mL-1、漢黃芩素0.0378 mg?mL-1、洋川芎內(nèi)脂0.00715 mg?mL-1、白術(shù)內(nèi)酯0.042 mg?mL-1。

1.2.2 樣品溶液的制備

取1丸安胎丸，剪碎，取約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，密塞，稱量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，再稱量，用甲醇補(bǔ)足減失的量，搖勻，即得供試品溶液（平行制備三份）。

1.2.3 色譜條件[11]及測定方法

色譜柱Diamonsil Plus C18-A(250×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.1%磷酸溶液（A）：乙腈（B），梯度洗脫（0-15 min，5%-20%B；15-40 min，20%-40%B；40-45 min，40%-70%B；45-55 min，70%-90%B；55-60 min，90%-95%B）；流速 0.8 mL·min-1；柱溫 35℃；檢測波長280 nm；根據(jù)六種關(guān)鍵指標(biāo)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)公式(圖1)，達(dá)到了令人滿意的分離效果。樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液采用0.45 μm微孔膜過濾，分別取10 μL經(jīng)HPLC檢測。所測得的數(shù)值作為六種關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)性成分的含量真實(shí)值。

混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液均經(jīng)HPLC儀測定安胎丸中關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分的含量。

1.3 關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分的近紅外測定方法

1.3.1 近紅外光譜數(shù)據(jù)的采集

取12批（共108丸）的安胎丸樣品，采用近紅外光譜儀進(jìn)行近紅外光譜數(shù)據(jù)的采集，按如下條件掃描：漫反射模式，分辨率2 nm，掃描次數(shù)32次，波長掃描范圍1000-1800 nm。每丸重復(fù)掃描3次，得出平均的準(zhǔn)確的光譜數(shù)據(jù)保存為txt格式，并轉(zhuǎn)換為CVS格式。

1.3.2 光譜的預(yù)處理

光譜預(yù)處理對(duì)于獲得可靠、穩(wěn)定和準(zhǔn)確的模型至關(guān)重要，因?yàn)榻t外的光譜的數(shù)據(jù)中可能包含噪聲、背景信息和其他干擾因素[12]。本研究中，分別近紅外采集的光譜進(jìn)行了預(yù)處理，比較了一階導(dǎo)數(shù)卷積（1stderivative，1DC）、二階導(dǎo)數(shù)卷積（2ndderivative，2DC）、多元散射校正（Multiplicative Scatter Correction，MSC）、標(biāo)準(zhǔn)正變變換（Standard Normal Variate，SNV）、Savitzky-Golay卷積平滑（S-G）和歸一化法（Normalization Method）等光譜預(yù)處理方法。

1.3.3 模型的建立及預(yù)測方法

采用THUNIR軟件[13-14]，根據(jù)HPLC測定的六種關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分的真實(shí)含量值，對(duì)采集到的光譜進(jìn)行光譜預(yù)處理和波段選擇，選擇偏最小二乘法（partial least squares，PLS）[15]，建立六種成分的定量校準(zhǔn)模型。

模型的優(yōu)劣主要以交叉驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)誤差（SECV）和相關(guān)系數(shù)（R2）進(jìn)行評(píng)估[12-13]。

采用建立的定量校正模型，對(duì)安胎丸中六種關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分的含量進(jìn)行預(yù)測，并與HPLC測定結(jié)果進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分的實(shí)際值測定

2.1.1 HPLC測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法學(xué)考察

采用高效液相色譜法繪制了安胎丸六種關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線：阿魏酸：Y=56.5343 x+56.5343（0.0006-0.0245 μg）；黃芩苷：Y=43.9359 x+43.9359（0.0205-0.8200 μg）；漢 黃 芩苷 ：Y=57.4254 x+57.4254（0.0092-0.1840 μg）；黃芩素：Y=87.5326 x+87.5326（0.0128-0.5120 μg）；漢黃芩素：Y=90.0406 x+90.0406（0.0076-0.3780μg）；洋川芎內(nèi)酯 A：Y=14.5638 x+0.0075（0.0014-0.1072μg）。

方法學(xué)考察中，精密度試驗(yàn)的RSD值為0.53%-0.85%、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD值為2.28%-4.71%、穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD值為0.75%-4.00%，均低于5%。加樣回收率試驗(yàn)采用加入100%濃度的六份樣品進(jìn)行測定，回收率在98%-105%之間，RSD低于3%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，方法學(xué)考察均符合要求，可見該HPLC測定方法的精度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好、回收率高。

圖2 安胎丸的HPLC圖

表1 安胎丸中關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分的含量測定表（mg·pill-1）

續(xù)表1

表2 安胎丸關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分的含量測定表（mg·pill-1）

圖2是安胎丸樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的HPLC色譜圖，表明六種關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分不存在有峰干擾，且各成分歸屬于不同的色譜峰，可以準(zhǔn)確進(jìn)行定量，定量結(jié)果見表1。

2.2 關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分的近紅外定量模型的建立

2.2.1 近紅外校正集樣本和驗(yàn)證集樣本的劃分

針對(duì)上述測定的每一批號(hào)中各丸所含質(zhì)控指標(biāo)成分的含量，將所有的樣本（108丸）分為校準(zhǔn)集和預(yù)測集。且分別由84個(gè)和24個(gè)樣本組成，如表2所示，并對(duì)校正集或驗(yàn)證集的六個(gè)質(zhì)控指標(biāo)成分含量進(jìn)行比較，校準(zhǔn)集的含量范圍更大，且含量數(shù)據(jù)分布均勻，符合建模條件。

2.2.2 近紅外光譜的特性分析

近紅外光譜分析常用的光譜區(qū)域是780-2500 nm，所測特征是分子振動(dòng)基頻，尤其是伸縮和彎曲振動(dòng)的倍頻和組合頻吸收帶[15]。圖3顯示了安胎丸的原始光譜圖和預(yù)處理光譜圖的光譜。在卷積平滑的光譜預(yù)處理中，1150-1210 nm、1300-1500 nm和1450-1600 nm均有較大響應(yīng)，這與-CH2、和-CH的二級(jí)倍頻、-OH的伸縮振動(dòng)有關(guān)[15]。

2.2.3 主成分分析

主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）是一種根據(jù)光譜分?jǐn)?shù)對(duì)不同樣本進(jìn)行分類的合適方法，可用于驗(yàn)證光譜的一致性[16]。圖4顯示了光譜的得分圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，12批次安胎丸從其PCA得分圖看出，兩年內(nèi)生產(chǎn)的樣本不存在明顯的異常值。因此，108丸安胎丸具有光譜的一致性。

2.2.4 近紅外光譜的預(yù)處理和波段選擇

對(duì)近紅外光譜儀采集的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行光譜預(yù)處理，可以消除偏移或基線的變化，從而保證光譜數(shù)據(jù)和成分之間很好的相關(guān)性[13]。在本研究中，選擇光譜掃描范圍為1000-1800 nm。考察幾種光譜預(yù)處理方法包括：S-G、1DC、2DC、MSC、SNV等不同預(yù)處理方法，最大程度地減少光譜中存在的干擾，并對(duì)上述光譜預(yù)處理方法進(jìn)行比較，分別選出最佳光譜預(yù)處理方法：六種質(zhì)控指標(biāo)成分的最佳光譜預(yù)處理方法均為卷積平滑（窗口數(shù)為11，擬合次數(shù)為3）[17]。

校正模型建立時(shí)，有時(shí)并不需要所有的光譜數(shù)據(jù)都參與校正，而只用某些光譜區(qū)間就可以得到很好的校正效果，這樣可以減少參與建模的數(shù)據(jù)量，降低不相關(guān)區(qū)間的噪音干擾。因此，本研究中，采用化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件提供的光譜區(qū)間選擇功能，進(jìn)行不同的波長選擇方法的比較，優(yōu)選出最佳波段進(jìn)行模型的建立，最佳波段的優(yōu)選結(jié)果見表3。

圖4 安胎丸全部樣本的近紅外光譜PCA得分圖

2.2.5 模型主因子數(shù)的確定

采用PLS方法建立定量分析模型時(shí)，主因子數(shù)的選擇直接影響到模型的實(shí)際預(yù)測能力，如果選擇的主因子太少，將會(huì)丟失原始光譜較多的有用信息，導(dǎo)致擬合不充分；如果選擇主因子太多，會(huì)將測量噪音過多的包括進(jìn)來，出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，所建模型的預(yù)測誤差會(huì)顯著增大[18]。本研究以黃芩苷為例，隨著主因子數(shù)增加，SECV陡然下降，防止存在過擬合現(xiàn)象，因此，選擇主因子數(shù)為7。

2.2.6 建立最佳定量校準(zhǔn)模型

定量校正也稱多元校正[19]，是指在物質(zhì)含量與分析儀器響應(yīng)值之間建立定量關(guān)聯(lián)關(guān)系。PLS屬于線性方法，是基于有偏估計(jì)的方法，能同時(shí)對(duì)回歸問題進(jìn)行降維處理[19]。

本研究中根據(jù)表1中六種質(zhì)控指標(biāo)成分的含量測定結(jié)果，采用THUNIR軟件，應(yīng)用卷積平滑的光譜預(yù)處理方法，選擇優(yōu)化后的最佳波長，結(jié)合偏最小二乘法分別建立近紅外光譜測定安胎丸六種成分的定量校正模型。六種成分的定量分析模型參數(shù)見表3。

圖5 黃芩苷定量分析校正模型最佳主因子數(shù)的選擇

2.3 定量校準(zhǔn)模型的驗(yàn)證

采用建立的六種關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)成分的定量校準(zhǔn)模型，分別對(duì)剩余的24個(gè)驗(yàn)證集樣本進(jìn)行含量預(yù)測，如圖6，結(jié)果顯示安胎丸中的六種關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)性成分的真實(shí)值與預(yù)測值高度匹配，其預(yù)測的相關(guān)系數(shù)R2均≥0.90，表明六個(gè)模型具有較好的預(yù)測能力。

表3 安胎丸質(zhì)控指標(biāo)成分最佳模型校正參數(shù)

圖6 安胎丸六種質(zhì)控指標(biāo)性成分的預(yù)測值與真實(shí)值擬合圖

3 討論

本研究采用近紅外漫反射光譜分析技術(shù)，成功地對(duì)安胎丸進(jìn)行了六種質(zhì)控指標(biāo)成分的定量分析，該方法可以無損、快速、準(zhǔn)確地對(duì)該中成藥進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。與市場抽樣檢驗(yàn)方法比較，可以節(jié)省大量分析時(shí)間及費(fèi)用，有著良好的市場實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景，為中成藥市場的抽樣檢驗(yàn)提供新思路和新方法。