近紅外光譜法快速測(cè)定山銀花中四種有機(jī)酸＊

張 易，方 婷，馬晉芳，凌亞東，彭 銀，葛發(fā)歡＊＊

（1.中山大學(xué)藥學(xué)院 廣州 510006；2.廣東省中藥超臨界流體萃取工程技術(shù)研究中心 廣州 510006；3.廣東藥科大學(xué)廣州 510006；4.廣州訊動(dòng)網(wǎng)絡(luò)科技有限公司 廣州 510630）

山銀花是忍冬科植物灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.）、紅 腺 忍 冬（Lonicera hypoglauca Miq.）、華南忍冬（Lonicera confusa DC.）或黃褐毛忍冬（Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng）的干燥花蕾或初開的花，為中醫(yī)常用藥，應(yīng)用歷史悠久[1]，具有清熱解毒，疏散風(fēng)熱的作用，用于治療癰腫疔瘡，喉痹，丹毒，熱毒血痢，風(fēng)熱感冒，溫?zé)岚l(fā)病[2]。山銀花中有機(jī)酸的種類主要有咖啡?？鼘幩犷悾òňG原酸、異綠原酸、新綠原酸等）和咖啡酸[3]，其中綠原酸和異綠原酸類成分（異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C等）為山銀花的主要抗菌活性成分[4]。目前多采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定山銀花中綠原酸和異綠原酸成分的含量，并進(jìn)行質(zhì)量控制研究[4-6]，該分析方法大多需要破壞樣品，需對(duì)樣品預(yù)處理、提取、稀釋、檢測(cè)分析等復(fù)雜步驟，耗時(shí)耗力。

近紅外光譜（near-infrared spectroscopy，NIR）分析技術(shù)是目前發(fā)展最快和最具有前景的過程分析技術(shù)之一，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物化學(xué)成分含量預(yù)測(cè)[7,8]，具有樣品處理簡(jiǎn)單、無損耗、快速等諸多優(yōu)點(diǎn)。已有報(bào)道NIR技術(shù)測(cè)定金銀花藥材和提取過程中多種指標(biāo)成分的含量[9-11]，但尚未有用該方法同時(shí)快速測(cè)定山銀花提取過程中多指標(biāo)成分含量的文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究將NIR應(yīng)用于山銀花提取過程中綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C含量的快速分析，利用偏最小二乘（PLS）法建立四種有機(jī)酸的定量校正模型，模型經(jīng)評(píng)價(jià)后用于測(cè)定未知樣品（驗(yàn)證集）四種成分的含量，采用相關(guān)系數(shù)、預(yù)測(cè)均方根誤差及相對(duì)預(yù)測(cè)偏差評(píng)價(jià)NIR預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，建立NIR快速測(cè)定山銀花提取過程中綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C含量的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

近紅外光譜儀（型號(hào)：NGD-U10，廣州訊動(dòng)網(wǎng)絡(luò)科技有限公司）；Matlab2012a版軟件（美國(guó)MathWorks公司）；Ultimate 3000 HPLC儀（包括梯度泵SR-3000、自動(dòng)進(jìn)樣器WPS-3000、柱恒溫系統(tǒng)TCC-3000、紫外檢測(cè)器DAD-3100、色譜工作站變色龍7.2）（賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）；十萬分之一分析天平（型號(hào)：XS205 DuaLRange，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。

1.2 材料

山銀花（市售），經(jīng)中山大學(xué)藥學(xué)院葛發(fā)歡教授鑒定為忍冬科植物山銀花的花蕾，存放于中大南沙研究院；綠原酸（批號(hào)：110753-200413，純度≥98%，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；異綠原酸A（批號(hào)：15041720）、異綠原酸B（批號(hào)：15042210）、異綠原酸C（批號(hào)：15110702）均采購(gòu)自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，純度≥98%；乙腈（色譜純，德國(guó)默克公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品采集

取山銀花粉末約100 g，加3 000 mL水，80℃加熱回流2 h，每隔2 min收集一次提取液，共提取4批，得到240個(gè)樣品，其中2批樣品用于建立校正模型，2批樣品用于驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性。

2.2 NIR譜圖的采集

用近紅外光譜儀對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行近紅外掃描。波長(zhǎng)掃描范圍為950-1 650 nm，每次光譜掃描次數(shù)為100次，分辨率為2 nm，每個(gè)提取液樣品重復(fù)掃描3次。計(jì)算光譜平均值。樣品的近紅外圖譜見圖1。

2.3 山銀花提取液中四種有機(jī)酸的含量測(cè)定

精密稱取各標(biāo)準(zhǔn)品適量，用50%甲醇溶解至刻度，得到混合標(biāo)準(zhǔn)品母液儲(chǔ)備液。然后精密吸取適量?jī)?chǔ)備液制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。色譜柱為Sharpsil-AQC18（250 mm×4.6 mm,5 μm），流動(dòng)相為A為0.4%磷酸水溶液，B為乙腈，梯度洗脫（0-15 min，15%B，15-30 min，15%-30%B，30-45 min 30%B，45-48 min，30%-15%B），流速為0.5 mLmin-1，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm。取“2.1”項(xiàng)下的樣品，過0.45 nm濾膜，取濾液進(jìn)行液相分析。四種有機(jī)酸的分離度、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性均符合分析要求。線性方程分別為：y=31.637x-0.076 2（綠原酸）；y=37.035x-0.062 5（異綠原酸 A）；y=29.674x-0.017 7（異綠原酸 B）；y=32.033x-0.062 7（異綠原酸C）。相關(guān)系數(shù)R2均為1.000。四種成分的校正集和驗(yàn)證集的HPLC含量及數(shù)據(jù)分析分別見表1、表2。

圖1 山銀花提取液近紅外圖譜

2.4 定量分析模型的建立

2.4.1 波段的選擇

采用Matlab2012a版軟件進(jìn)行建模，四種有機(jī)酸的建模波段為950-1 650 nm。通過交叉驗(yàn)證均方根誤差（RMSECV）和預(yù)測(cè)均方根誤差（RMSEP）對(duì)建模波段進(jìn)行評(píng)價(jià)[12]。當(dāng)RMSEP值遠(yuǎn)大于RMSECV值時(shí)，說明選擇的建模樣品的代表性差，而當(dāng)RMSEP值遠(yuǎn)小于RMSECV值時(shí)，表明驗(yàn)證樣品的代表性差。本文采用全光譜范圍即950-1 650 nm進(jìn)行建模，從表3可以看出，RMSEP和RMSECV值均較小且接近，說明選擇的樣品具有代表性。因此選擇建模波段為950-1 650 nm。

2.4.2 主因子數(shù)的選擇

主因子數(shù)的大小對(duì)PLS模型的預(yù)測(cè)效果有顯著影響。主因子數(shù)過少，會(huì)出現(xiàn)“欠擬合”現(xiàn)象；而主因子數(shù)過多則出現(xiàn)“過擬合”現(xiàn)象，兩者均會(huì)導(dǎo)致模型的預(yù)測(cè)能力下降[13]。故本實(shí)驗(yàn)采取內(nèi)部交叉驗(yàn)證方法，考察不同主因子數(shù)對(duì)RMSECV的影響，優(yōu)選出最佳的主因子數(shù)。結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，隨著主因子數(shù)增加，RMSECV陡然下降。RMSECV值最小時(shí)，對(duì)應(yīng)的四種有機(jī)酸的最佳主因子數(shù)分別為：19、19、19和18。

2.4.3 模型的建立及外部驗(yàn)證

表2 四種成分在校正集和驗(yàn)證集中的HPLC含量測(cè)定結(jié)果分析

表3 四種有機(jī)酸模型的內(nèi)部交叉驗(yàn)證及外部驗(yàn)證結(jié)果

為了檢驗(yàn)校正模型的可靠性與穩(wěn)定性，除了進(jìn)行內(nèi)部交叉驗(yàn)證以外，還需對(duì)模型進(jìn)行外部檢驗(yàn)。根據(jù)相關(guān)性來判斷是否具有異常值。將HPLC法測(cè)得的綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C含量值與其950-1 650 nm波段下的NIR譜圖導(dǎo)入軟件，得到四種成分的定量分析模型及其預(yù)測(cè)值。模型性能評(píng)價(jià)指標(biāo)匯總見表3。四種成分的預(yù)測(cè)值與真實(shí)值的相關(guān)圖見圖3。當(dāng)R值越接近于1時(shí)，模型的預(yù)測(cè)越準(zhǔn)確；當(dāng)RMSECV值越小且與RMSEP接近，相對(duì)預(yù)測(cè)偏差RSEP越小時(shí)表明模型預(yù)測(cè)效果越好。結(jié)果表明，所建模型的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性良好，校正集樣本均勻地分布在回歸線的兩側(cè)，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的線性相關(guān)性較好。所建模型對(duì)驗(yàn)證集中四種有機(jī)酸含量的預(yù)測(cè)結(jié)果見圖4。四種成分的相對(duì)預(yù)測(cè)偏差RSEP值較小，能夠滿足中藥實(shí)際生產(chǎn)過程中分析精度的要求。

3 討論

本研究應(yīng)用NIR分析技術(shù)建立了山銀花提取過程中綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B及異綠原酸C四種成分同時(shí)快速檢測(cè)方法。所構(gòu)建的PLS定量模型通過初步驗(yàn)證具有良好的穩(wěn)定性和精確度，相對(duì)預(yù)測(cè)偏差RSEP在合理范圍內(nèi)，可用于對(duì)未知樣品的預(yù)測(cè)。

在實(shí)際提取過程中，如果采用在線控制系統(tǒng)，只需要掃描山銀花提取物的NIR光譜，并將其代入所建立的定量模型中即可同時(shí)快速預(yù)測(cè)綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B及異綠原酸C成分的含量。樣品分析極其簡(jiǎn)單，極大節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間（一般一個(gè)樣品掃描一次只需1～2 s），提高了分析效率。該方法彌補(bǔ)了傳統(tǒng)HPLC分析存在的費(fèi)時(shí)費(fèi)力、環(huán)境污染等缺陷，具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖2 四種有機(jī)酸定量模型的最佳主因子數(shù)選擇

圖3 四種有機(jī)酸的NIR預(yù)測(cè)值與HPLC測(cè)定值的相關(guān)性

圖4 驗(yàn)證集中四種有機(jī)酸NIR預(yù)測(cè)值與真實(shí)值的相對(duì)趨勢(shì)