丹參素鈉大孔樹脂吸附分離過程的近紅外在線監(jiān)測(cè)研究＊

馬晉芳，畢昌瓊，歐邦露，肖 雪，王雪利，葛發(fā)歡＊＊

（1.中山大學(xué)藥學(xué)院 廣州 510006；2.中山大學(xué)南沙研究院 廣州5 11458；3.貴州景峰注射劑有限公司 貴陽 550018；4.廣東藥科大學(xué) 廣州 510006；5.廣東省中藥超臨界流體萃取工程技術(shù)研究中心 廣州 510006）

丹參為傳統(tǒng)名貴中藥，是唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根莖，味苦，性微寒，歸心、肝二經(jīng)，具有活血祛瘀，通經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰的功效[1]。參芎葡萄糖注射液是由丹參、鹽酸川芎嗪經(jīng)過現(xiàn)代工藝制造的一種用于閉塞性腦血管疾病及其他缺血性血管疾病的現(xiàn)代復(fù)方制劑[2-4]。丹參中的水溶性酚酸類成分主要有丹參素、丹酚酸B等?，F(xiàn)代藥理研究表明，丹參酚酸類成分具有改善循環(huán)、抑制血小板聚集、抗氧化、增加冠脈流量及心肌供氧量等作用，是丹參祛瘀、活血的主要活性成分[5-6]。

參芎葡萄糖注射液中，丹參其經(jīng)過復(fù)雜的生產(chǎn)工藝制備得到以丹參素為主要成分的提取物。因此，為了保證該產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性和均一性，同時(shí)為了節(jié)約企業(yè)成本，需要對(duì)生產(chǎn)過程進(jìn)行質(zhì)量控制，但目前實(shí)際生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制缺乏在線監(jiān)測(cè)手段，無法及時(shí)地對(duì)有效成分含量做出分析。由于近紅外光譜（NIR）是近年來發(fā)展迅速且應(yīng)用廣泛的一種分析技術(shù)，且具有分析方便快速，綠色環(huán)保，可多成分同時(shí)在線檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[7]。

本研究采用近紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)，對(duì)丹參大孔樹脂吸附分離過程中的丹參素鈉含量進(jìn)行定量分析，并在線監(jiān)測(cè)大孔樹脂吸附分離過程中丹參素鈉含量的變化，為參芎葡萄糖注射液大生產(chǎn)過程中大孔樹脂吸附分離單元的在線質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

圖1 丹參素鈉大孔樹脂吸附分離階段在線近紅外原始光譜

1 材料和方法

1.1 儀器和藥材

UltiMate 3000高效液相色譜儀（美國戴安公司）；XS205 DuaLRange型十萬分之一分析天平（梅特勒-托利多）；UV-2600紫外分光光度計(jì)（島津（中國）有限公司）；Matrix-F近紅外光譜儀（德國布魯克公司）；化學(xué)計(jì)量學(xué)分析系統(tǒng)（THUNIR V3.0（Demo），清華大學(xué)），在線監(jiān)測(cè)分析系統(tǒng)（THU NIR Online（Demo），清華大學(xué)）；中小型提取罐（30 L）。乙腈（色譜級(jí)，德國默克），甲酸（分析級(jí)，廣州化學(xué)試劑廠）；丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：111562-201514，中國食品藥品檢定研究院）；丹參素鈉標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：110855-201412，中國食品藥品檢定研究院）；丹參提取液、丹參柱層析液（實(shí)驗(yàn)室中試生產(chǎn)線制備）。

1.2 收集樣品

丹參藥材300 kg，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室中試生產(chǎn)線制備得到的丹參素鈉提取物，經(jīng)大孔樹脂上樣吸附后，用6 BV純化水進(jìn)行沖洗，流速均為6 BV/h，從開始收集水洗液的同時(shí)，每隔1 min采樣一次，過0.45 μm微孔濾膜，置于密封容器中存放（共制備五批樣本）。

1.3 丹參素鈉的含量測(cè)定

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna 5u C18(2)100A（250×4.6 mm）；流動(dòng)相體系：乙腈（A相）-0.4%甲酸水溶液（B相）；梯度洗脫，0～18 min，7%～14%A，流速為1 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長：280 nm，檢測(cè)器：DAD檢測(cè)器，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 溶液的配制

精密稱取丹參素鈉標(biāo)準(zhǔn)品7.02 mg于10 mL容量瓶中，加適量水溶解并定容至刻度，搖勻，作為丹參素鈉對(duì)照品溶液。收集大孔樹脂工藝水洗液樣品，作為供試品溶液。

1.3.3 測(cè)定方法

分別對(duì)照品溶液和供試品溶液，經(jīng)HPLC測(cè)定其中丹參素鈉的含量。

1.4 NIR光譜的采集[8-9]

大孔樹脂吸附分離過程中，采用透射在線采集，以空氣為背景，光程2 mm，掃描范圍800～2 500 nm，分辨率2 nm，掃描次數(shù)32次，每個(gè)采樣點(diǎn)重復(fù)掃描3次，求平均光譜，采集的近紅外原始光譜圖如圖1所示。

1.5 數(shù)據(jù)處理與軟件

根據(jù)THU NIR Online（Demo）[10]在線監(jiān)測(cè)分析系統(tǒng)對(duì)大孔樹脂工藝過程終點(diǎn)的判定和吸附分離過程的趨勢(shì)的判斷，選擇符合生產(chǎn)條件的樣本。

采用THUNIR V3.0（Demo）化學(xué)計(jì)量學(xué)分析系統(tǒng)，結(jié)合馬氏距離圖對(duì)樣品中存在的異常點(diǎn)進(jìn)行剔除，確定建模所用的校正集、外部驗(yàn)證集及在線驗(yàn)證集。然后在此基礎(chǔ)上對(duì)原始光譜進(jìn)行光譜預(yù)處理，并選擇建模的光譜區(qū)間，結(jié)合偏最小二乘法對(duì)樣本的光譜與其性質(zhì)的相應(yīng)含量值建立定量校正模型。

通過驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)值的精度和可信度，進(jìn)而判斷模型的優(yōu)劣以及擬合程度，也稱為模型精度的評(píng)價(jià)[11-12]，模型精度高，證明該模型具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，對(duì)未知樣本的預(yù)測(cè)才具有意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)方法的測(cè)定值

高效液相色譜法建立丹參素鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為Y=7.5479X-0.0825，R2=0.9999，線性范圍在 0.0035～1.4040 mg·mL-1。作為校正集批次1～3的丹參素鈉質(zhì)量濃度范圍在0.0009～1.1740 mg·mL-1，作為外部驗(yàn)證集批次4的丹參素鈉質(zhì)量濃度范圍在0.0011～1.0245 mg·mL-1，作為在線驗(yàn)證集批次5的丹參素鈉質(zhì)量濃度范圍在0.0011～0.8650 mg·mL-1。結(jié)果表明外部驗(yàn)證集和在線驗(yàn)證集的丹參素鈉質(zhì)量濃度均落在校正集范圍內(nèi)，具體測(cè)定結(jié)果見表1～3。

2.2 近紅外定量校正模型的建立

2.2.1 在線監(jiān)測(cè)軟件分析大孔樹脂吸附分離階段

采用THU NIR Online（Demo）軟件對(duì)丹參大孔樹脂吸附分離過程中的各批次進(jìn)行分析比較[21]，光譜波長選擇為800-2500 nm，排除噪聲干擾，根據(jù)在線監(jiān)測(cè)分析的結(jié)果檢測(cè)目標(biāo)成分的變化情況，如圖2所示從左向右，曲線趨勢(shì)逐漸趨于平衡，提示達(dá)到柱層析終點(diǎn)。通過比較各個(gè)批次，選擇提取過程趨勢(shì)一致的五個(gè)批次進(jìn)行模型的建立與預(yù)測(cè)分析。

表1 校正集樣本中丹參素鈉含量測(cè)定結(jié)果表

續(xù)表1

表2 外部驗(yàn)證集中丹參素鈉的含量測(cè)定結(jié)果表

2.2.2 建模方法的選擇[13-15]

近紅外光譜分析技術(shù)中，常用的線性校正方法有多元線性回歸（MLR）法、主成分回歸（PCR）法、偏最小二乘（PLS）法。

多元線性回歸（MLR）法又稱為逆最小二乘法，該方法計(jì)算簡單，但由于光譜變量之間往往存在共線性問題，無法求光譜陣的逆矩陣或求取的逆矩陣不穩(wěn)定，從而在很大程度上降低了所建模型的預(yù)測(cè)能力，使MLR方法在近紅外光譜分析中的應(yīng)用受到了很大限制。

表3 在線驗(yàn)證集中丹參素鈉的含量測(cè)定結(jié)果表

主成分回歸（PCR）法是采用多元統(tǒng)計(jì)中的主成分分析（PCA）法，先對(duì)近紅外光譜矩陣進(jìn)行分解，然后選取主成分得分來進(jìn)行多元線性回歸運(yùn)算，得到定量模型。但PCR中，只對(duì)光譜陣進(jìn)行分解，消除無用的噪聲信息。

偏最小二乘（PLS）法是把矩陣分解和回歸并為一步，即對(duì)光譜陣和濃度陣分解的同時(shí)，將濃度陣的信息引入到光譜矩分解過程中，在每計(jì)算一個(gè)新主成分前，將光譜陣的得分與濃度陣的得分進(jìn)行交換，使得光譜陣主成分直接與濃度關(guān)聯(lián)。這樣可以克服PCR只對(duì)光譜陣進(jìn)行分解的缺點(diǎn)，且PLS建立的模型預(yù)測(cè)能力與穩(wěn)定性良好，噪音去除明顯，并能有效解決模型的過擬合與變量共線性。

因此，本研究選擇PLS法旨在得到穩(wěn)定性高、預(yù)測(cè)能力準(zhǔn)確的丹參素鈉定量校正模型。

2.2.3 光譜預(yù)處理

圖2 大孔樹脂吸附分離階段的在線監(jiān)測(cè)分析圖

本研究采用THUNIR V3.0（Demo）化學(xué)計(jì)量學(xué)分析系統(tǒng)，參考儀器自帶的優(yōu)化功能，對(duì)光譜預(yù)處理方法進(jìn)行優(yōu)化，剔除干擾信號(hào)，提取關(guān)鍵信息，來選擇最佳光譜預(yù)處理方法提高模型的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。光譜預(yù)處理方法中，卷積平滑可以消除噪音對(duì)光譜的影響，多元散射校正和標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換可以消除各批次間樣品產(chǎn)生的散射對(duì)其光譜的影響，一階卷積求導(dǎo)可以消除常數(shù)背景，二階卷積求導(dǎo)消除線性背景等等。不同的光譜預(yù)處理方法所建立的模型性能評(píng)價(jià)指標(biāo)見表4。結(jié)果顯示丹參素鈉建模光譜最佳預(yù)處理方法為二階卷積求導(dǎo)。

2.2.4 建模波段的選擇

圖3 丹參素鈉定量校正模型預(yù)測(cè)趨勢(shì)圖

表4 丹參素鈉光譜預(yù)處理方法的選擇

表5 建模波段的比較結(jié)果表

偏最小二乘法雖可以處理全光譜信息，但因其中會(huì)含有大量無效的信息，故需要對(duì)最佳的波長范圍進(jìn)行篩選，以消除干擾，提高模型的精度。本研究采用二階卷積求導(dǎo)的光譜預(yù)處理方法，通過比較全波長、相關(guān)系數(shù)法、迭代優(yōu)化波長選擇方法，優(yōu)選最佳建模波段為833～1 165 nm，1 498～1 890 nm，具體見表5。

2.2.5 模型的建立

運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)分析系統(tǒng)THUNIR V3.0（Demo）軟件，對(duì)上述光譜預(yù)處理方法和建模波段進(jìn)行優(yōu)選，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法的測(cè)定值，采用PLS法建模，得丹參素鈉定量校正模型的R2值為0.8473，SECV值為0.1776。

2.3 近紅外定量校正模型的外部驗(yàn)證與在線驗(yàn)證[16-19]

對(duì)劃分的外部驗(yàn)證集和在線驗(yàn)證集進(jìn)行丹參素鈉的含量預(yù)測(cè)，并與HPLC法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，外部驗(yàn)證集的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，從純水洗脫開始，最初7個(gè)樣本和最終8個(gè)樣本的預(yù)測(cè)值和真實(shí)值的相對(duì)偏差大于10%，其余樣本的相對(duì)偏差都較?。辉诰€驗(yàn)證集的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，從純水洗脫開始，最初8個(gè)樣本和最終12個(gè)樣本的預(yù)測(cè)值和真實(shí)值的相對(duì)偏差大于10%，其余樣本的相對(duì)偏差都較小。可見，在大孔樹脂吸附分離過程中，水洗階段最初收集液部分和最終收集液部分中，所含丹參素鈉的含量太低，導(dǎo)致模型的預(yù)測(cè)不準(zhǔn)確，只能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)出水洗液中丹參素鈉的含量趨勢(shì)和提示水洗的起點(diǎn)和終點(diǎn)，而中間部分由于洗脫液中丹參素鈉的含量高，所以可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，具體見圖3。

3 討論

本研究利用近紅外光譜法，在線對(duì)參芎葡萄糖注射液大孔樹脂吸附分離中試生產(chǎn)過程進(jìn)行丹參素鈉的質(zhì)量控制，通過二階卷積求導(dǎo)的光譜預(yù)處理方法和選擇最佳波段（833～1 165 nm，1 498～1 890 nm），結(jié)合PLS法建立定量校正模型，不僅可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)大孔樹脂吸附分離過程中丹參素鈉的含量，同時(shí)可以準(zhǔn)確判斷大孔樹脂吸附分離的起點(diǎn)和終點(diǎn)，在參芎葡萄糖注射液大生產(chǎn)中，可以實(shí)現(xiàn)丹參素鈉實(shí)時(shí)監(jiān)控和在線分析，并且以其快速、環(huán)保的優(yōu)勢(shì)為其產(chǎn)品的生產(chǎn)節(jié)約成本，提高效率，可以作為一種中藥制藥過程中質(zhì)量控制的新方法在中藥制劑的復(fù)雜工藝中試行及推廣。

此外，大孔樹脂吸附分離過程不同于普通的提取過程，由于洗脫液中目標(biāo)成分的含量是從無到有，再到無，結(jié)合近紅外光譜本身的缺點(diǎn)是不能檢測(cè)含量太低的物質(zhì)，所以在采用近紅外檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行質(zhì)量控制時(shí)，對(duì)洗脫的起點(diǎn)和終點(diǎn)，僅能做準(zhǔn)確判斷，無法做到準(zhǔn)確定量，目前應(yīng)用暫僅對(duì)洗脫的中間部分進(jìn)行準(zhǔn)確定量。