水飛薊素對(duì)人胃癌SGC 7901細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用及其機(jī)制

袁虎勤，李 強(qiáng)

(1.甘肅省腫瘤醫(yī)院腸胃外科，甘肅 蘭州 730050；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院腸胃外科，甘肅 蘭州 730000)

胃癌的發(fā)生率呈逐年上升的趨勢(shì)，患者死亡率高，在我國(guó)高發(fā)性消化系腫瘤中占第1位，且就診患者多數(shù)已進(jìn)入晚期。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗癌藥物治療腫瘤的重要機(jī)制之一。對(duì)于胃癌患者，目前臨床治療仍以化療為主，但不良反應(yīng)大，療效差，故開(kāi)發(fā)新藥以提高療效及減輕患者痛苦尤為重要。水飛薊素是一種黃酮木脂素類化合物，具有抗癌、抗氧化、抗炎、降血脂和神經(jīng)保護(hù)等作用，其發(fā)揮主要活性作用的是水飛薊素及其復(fù)合物[1]。水飛薊素主要作用于細(xì)胞增殖旺盛的組織或器官，其抗癌機(jī)制呈現(xiàn)多靶點(diǎn)、多步驟和全方位等特點(diǎn)，因此在腫瘤治療中展現(xiàn)了潛在的應(yīng)用價(jià)值[2]。國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究[3-4]表明：水飛薊素可明顯抑制某些腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化以及抑制腫瘤血管生成等。Chen等[5]發(fā)現(xiàn)：水飛薊素能抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和DNA合成。劉志剛等[6]研究證明：水飛薊素可抑制人膀胱癌細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期阻滯在G1期。Cheung等[7]研究顯示：水飛薊素具有抑制肺癌SHP-77細(xì)胞的生長(zhǎng)及加速細(xì)胞凋亡的作用。然而，水飛薊素對(duì)人胃癌細(xì)胞的影響及機(jī)制尚不清楚。本研究以不同濃度水飛薊素干預(yù)人胃癌SGC 7901細(xì)胞，初步探討水飛薊素對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及機(jī)制，為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 人胃癌SGC 7901細(xì)胞(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物教研室)。水飛薊素(西安小草植物科技有限責(zé)任公司)，RPMI 1640 培養(yǎng)基和胰蛋白酶(美國(guó)Hycone公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，二甲基亞砜(美國(guó)Sigma公司)， 2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(百奧生物公司)。Transwell 小室(中國(guó)Coming公司)，轉(zhuǎn)膜夾(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，TGL-168高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋公司)，IX51-A12PH 型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和形態(tài)表現(xiàn)觀察 人胃癌SGC 7901細(xì)胞培養(yǎng)在含10%小牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 g·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于飽和溫度、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育。倒置顯微鏡下觀察水飛薊素作用前后SGC 7901細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)和生長(zhǎng)狀況。

1.3 MTT法檢測(cè)各組SGC 7901細(xì)胞增殖抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC 7901細(xì)胞消化后稀釋成1×105mL-1，每孔200 μL加入96孔培養(yǎng)板中。24 h后，加入含不同濃度(0、15、30和60 mg·L-1)水飛薊素的培養(yǎng)基(每樣設(shè)5個(gè)復(fù)孔)，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h，每孔加入MTT溶液100 μL，37℃再培養(yǎng)4 h，充去液體，每孔再加入二甲基亞砜150 μL，振蕩10 min。利用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度(A)值，利用公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC 7901細(xì)胞消化后稀釋成1×105mL-1接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h后，加入含不同濃度水飛薊素(0、15、30和60 mg·L-1)的培養(yǎng)基；培養(yǎng)24 h后，消化，低溫、1 500 r·min-1離心10 min，用PBS洗滌3次，加入70%冷乙醇中，-20℃固定24 h，低溫、1 500 r·min-1離心10 min，用PBS洗滌3次，樣品上機(jī)加入0.5 mL碘化丙啶染色液，避光4℃染色30 min。利用ModFit分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析，檢測(cè)各組細(xì)胞周期。利用以下公式計(jì)算各組細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/(凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù))×100%。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組SGC 7901細(xì)胞遷移能力 將密度為1×105mL-1的SGC 7901細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板(包被Matrigel)中，培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，形成細(xì)胞單層后，沿培養(yǎng)板底部劃“一”字劃痕，測(cè)定劃痕區(qū)相對(duì)距離，PBS洗滌3次，對(duì)照組加含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，水飛薊素組分別加入含15、30和60 mg·L-1水飛薊素的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后更換新的RPMI 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。倒置顯微鏡下測(cè)量SGC 7901細(xì)胞向致傷區(qū)遷移的相對(duì)距離，記錄0和48 h相對(duì)距離，利用公式計(jì)算出細(xì)胞實(shí)際遷移距離。遷移距離=劃痕后0 h寬度-劃痕后48 h寬度。

1.6 Transwell小室法檢測(cè)各組SGC 7901細(xì)胞侵襲抑制率 將Transwell小室(包被Matrigel)每孔加入含10 g·L-1BSA的無(wú)血清培養(yǎng)液50 μL，37℃放置30 min，置入24孔培養(yǎng)板中，于上室每孔加入含有1×105mL-1細(xì)胞的懸液200 μL，于下室加入含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液600 μL，對(duì)照組加含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，水飛薊素組分別加入含15、30和60 mg·L-1水飛薊素的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，每組重復(fù)4個(gè)樣本，常規(guī)培養(yǎng)24～48 h。取出小室，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，臺(tái)盼藍(lán)溶液染色。倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)移至微孔膜下層的細(xì)胞。

2 結(jié) 果

2.1 各組SGC 7901細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn) 與對(duì)照組比較，30和60 mg·L-1水飛薊素組細(xì)胞貼壁密度變小，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、體積變小，產(chǎn)生大量細(xì)胞碎片，部分細(xì)胞漂浮，且60 mg·L-1水飛薊素組較30 mg·L-1水飛薊素組變化更為明顯，15 mg·L-1水飛薊素組變化不明顯。見(jiàn)圖1。

A：Control group；B-D：15,30,and 60 mg·L-1 silymarin groups.

2.2 各組SGC 7901細(xì)胞增殖抑制率和調(diào)亡率 與對(duì)照組比較，15、30和60 mg·L-1水飛薊素組SGC 7901細(xì)胞增殖抑制率明顯升高(P<0.05)，且60 mg·L-1水飛薊素組增殖抑制率升高最明顯。與對(duì)照組比較，不同濃度水飛薊素組細(xì)胞主要出現(xiàn)早期凋亡，凋亡率明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組SGC 7901細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率

Tab.1 Inhibitory rates of proliferation and apoptotic rates of SGC 7901 cells in various groups (n=5,±s,η/%)

*P<0.05 compared with control group.

2.3 各組SGC 7901細(xì)胞不同周期細(xì)胞百分率 與對(duì)照組比較,不同濃度水飛薊素組G0/G1期細(xì)胞百分率明顯升高(P<0.05)，而S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4 各組SGC 7901細(xì)胞遷移和侵襲能力 劃痕48 h后，對(duì)照組劃痕變窄，SGC 7901細(xì)胞向劃痕內(nèi)部遷移至劃痕區(qū)中部；與對(duì)照組比較，水飛薊素15、30和60 mg·L-1組劃痕間隙明顯加寬，細(xì)胞遷移距離明顯縮短(P<0.05)。Transwell穿膜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，15、30和60 mg·L-1水飛薊素組穿膜細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)圖2、3和表3。

表2 各組不同細(xì)胞周期SGC 7901細(xì)胞百分率

*P<0.05 compared with control group.

A-D：0 h；E-H：24 h；A，E：Control group；B，F(xiàn)：15 mg·L-1silymarin group；C，G：30 mg·L-1silymarin group； D，H：60 mg·L-1silymarin group.

圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組SGC 7901細(xì)胞遷移能力

Fig.2 Migration abilities of SGC 7901 cells in various groups detected by scratch test

A：Control group；B-D：15,30,and 60 mg·L-1 silymarin groups.

表3 各組SGC 7901細(xì)胞遷移距離和穿膜細(xì)胞數(shù)

Tab.3 Migration distances and transmembrane number of SGC 7901 cells in various groups (n=5,±s)

*P<0.05 compared with control group.

3 討 論

胃癌的發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)，患者死亡率高，在我國(guó)高發(fā)性消化系腫瘤中占第1位，且就診患者多數(shù)已進(jìn)入晚期[8-10]。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗癌藥物治療腫瘤的重要機(jī)制之一[11-13]，臨床抗腫瘤藥物存在不良反應(yīng)多等缺點(diǎn)。目前探尋治療效果好、不良反應(yīng)小或無(wú)毒的抗胃癌藥物是一個(gè)難點(diǎn)。水飛薊素是一種從天然植物水飛薊果實(shí)種皮中提取的黃酮木脂素類物質(zhì)[14-15]。研究[16-18]顯示：水飛薊素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用，但其作用機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。因此，本研究以人胃癌SGC 7901細(xì)胞作為研究對(duì)象，探討水飛薊素抑制人胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用。

細(xì)胞大量增殖是腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要原因，因此，干擾腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)代謝及增殖過(guò)程，誘發(fā)癌細(xì)胞凋亡對(duì)治療腫瘤具有重要意義[19-20]。本研究結(jié)果表明：不同濃度水飛薊素作用于人胃癌SGC 7901細(xì)胞后，細(xì)胞貼壁密度變小，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、體積變小，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，產(chǎn)生大量細(xì)胞碎片，SGC 7901細(xì)胞增殖活性受到明顯抑制，表明水飛薊素對(duì)人胃癌SGC 7901細(xì)胞增殖具有抑制作用；人胃癌SGC 7901細(xì)胞經(jīng)不同濃度水飛薊素作用24 h后，G0/G1期細(xì)胞百分率明顯升高，表明水飛薊素對(duì)SGC 7901細(xì)胞有周期阻滯作用，周期阻滯于G1期。目前，尚未見(jiàn)有關(guān)水飛薊素對(duì)人胃癌SGC 7901細(xì)胞遷移、侵襲能力影響的研究，本研究結(jié)果顯示：水飛薊素對(duì)人胃癌SGC 7901細(xì)胞遷移和侵襲能力具有明顯的抑制作用，并呈明顯的量效關(guān)系。

綜上所述，水飛薊素對(duì)人胃癌SGC 7901細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而影響人胃癌SGC 7901細(xì)胞的遷移和侵襲能力。本研究?jī)H探討了水飛薊素在體外對(duì)人胃癌SGC 7901細(xì)胞的作用，但水飛薊素通過(guò)何種途徑、何種靶點(diǎn)抑制人胃癌SGC 7901細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力和細(xì)胞周期仍待進(jìn)一步深入研究。