乳腺癌患者超聲圖像特征與人類上皮生長(zhǎng)因子受體2和Ki-67陽(yáng)性表達(dá)的關(guān)聯(lián)性分析

鄭 芳,歐陽(yáng)征仁，歐陽(yáng)靖霖，周詩(shī)力,羅 文

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲科，湖南 衡陽(yáng) 421001； 2.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院內(nèi)科學(xué)教研室，湖南 衡陽(yáng) 421001)

乳腺彩色多普勒超聲檢查是乳腺癌早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷的重要手段。研究[1]顯示：多普勒超聲檢查在乳腺癌診斷中占據(jù)重要的地位。Ki-67為常見的核蛋白質(zhì)，與細(xì)胞增殖有密切關(guān)聯(lián)[1]。研究[2]提示：Ki-67與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和分化密切關(guān)聯(lián)。人類上皮生長(zhǎng)因子受體 2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2) 也稱為CerbB-2，屬于原癌基因，與細(xì)胞生長(zhǎng)和分化有關(guān)，與乳腺癌的惡性程度呈正相關(guān)關(guān)系。如何通過無創(chuàng)的影像學(xué)技術(shù)直接或間接反映乳腺癌的預(yù)后因子，探尋二者間的關(guān)聯(lián)性，一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)聲，然而將彩色超聲與CerbB-2和Ki-67等指標(biāo)聯(lián)系的研究較少。本研究旨在通過超聲檢查分析乳腺癌影像學(xué)特征與CerbB-2和Ki-67表達(dá)的關(guān)系，為乳腺癌診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年11月—2016年11月在南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院接受治療的107例乳腺癌患者作為研究對(duì)象，患者年齡45～75歲，平均年齡(62.8±4.7)歲。按照病理分型：浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌58例，黏液癌36例，浸潤(rùn)性小葉癌13例。根據(jù)國(guó)際TNM(2011)標(biāo)準(zhǔn)[4]進(jìn)行劃分臨床分期：Ⅰ期乳腺癌患者59例，Ⅱ期乳腺癌患者35例，Ⅲ期乳腺癌患者13例。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者經(jīng)臨床病理診斷確診為乳腺癌；②均符合國(guó)際乳腺癌TNM(2011)標(biāo)準(zhǔn)；③均不伴有其他乳腺疾??；④患者及家屬均同意參與本次研究，并簽署知情同意書。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或自身患有其他惡性腫瘤者；②伴有其他乳腺疾病(如乳腺囊腫和乳腺炎等)者；③伴有神經(jīng)系統(tǒng)疾病及行為失常者。

1.2 試劑和主要儀器 CerbB-2試劑盒和Ki-67試劑盒(福州邁新生物技術(shù)公司)。彩色多普勒超聲檢測(cè)儀(GE LOGIQ E9，美國(guó)通用電氣公司)。

1.3 常規(guī)超聲檢測(cè) 應(yīng)用彩色多普勒超聲檢測(cè)儀，將探頭的頻率設(shè)置為7.5 MHz，患者取仰臥位，暴露患者乳腺，采用直接探測(cè)法在患者乳房象限行扇形檢查，發(fā)現(xiàn)病灶部位時(shí)，記錄乳腺腫塊的邊界、形狀、縱橫比、內(nèi)部回聲、后放回聲、鈣化及血流的情況。腫塊的血流信號(hào)參照Adler 半定量分級(jí)法：0級(jí)，無明顯血流；1級(jí)，小于2處的點(diǎn)狀血流；2級(jí)，發(fā)現(xiàn)1條血管或3～4處點(diǎn)狀血流；3級(jí)，發(fā)現(xiàn)大于1條的血管或4處以上的點(diǎn)狀血流。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Ki-67和CerbB-2的表達(dá) 術(shù)中或穿刺活檢取乳腺癌組織，嚴(yán)格按照試劑盒的說明操作進(jìn)行檢測(cè)，制作5 μm的石蠟切片，采用脫蠟、酒精水化以及水沖洗2次，之后行3次PBS液沖洗，每次3 min，行振蕩處理。pH6.0的枸櫞酸鹽內(nèi)煮沸15 min，加入H2O2孵育10 min后用PBS液沖洗3次，每次3 min。加入50 μL一抗溶液，孵育60 min后，用PBS液沖洗3次，每次3 min；除去PBS溶液，加入100 μL DBS溶液，5 min后沖洗、蘇木素染色，之后行PBS沖洗、乙醇脫水以及二甲苯溶液過濾封片。CerbB-2和Ki-67免疫染色陽(yáng)性判定[5]：CerbB-2檢測(cè)以細(xì)胞膜上出現(xiàn)黃色或棕黃色為陽(yáng)性，Ki-67檢測(cè)在細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色為陽(yáng)性。采用400倍顯微鏡觀察切片，在每個(gè)切片中觀察10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，記錄陽(yáng)性細(xì)胞百分率，以組織中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比值將其分為陰性和陽(yáng)性，陰性：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 0%～10%；陽(yáng)性：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>10%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。超聲征象特征及Ki-67和CerbB-2在乳腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率以百分率(%)表示，采用Spearman相關(guān)分析評(píng)估乳腺癌Ki-67和CerbB-2表達(dá)的關(guān)聯(lián)性。采用χ2檢驗(yàn)比較不同乳腺癌超聲圖像特征患者Ki-67、CerbB-2表達(dá)的差異，采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行乳腺癌患者5年生存結(jié)局的多因素生存分析。分析乳腺癌患者超聲特征與Ki-67和CerbB-2表達(dá)的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌超聲圖像特征 107例乳腺癌患者中，病灶直徑為 0.8～9.8 cm，病灶直徑>2 cm者67例(62.6%)，形態(tài)不規(guī)則者54例(50.5%)，邊界不清晰者55例(51.4%)，腫瘤縱橫比>1者43例(40.2%)，內(nèi)部回聲不均勻者67例(62.6%)，腫瘤的后方回聲衰減32例 (29.9%)，腫塊中發(fā)現(xiàn)細(xì)小鈣化者33例(30.8%)，CDFI 顯示血流分級(jí) 2～3 級(jí)者52例(48.6%)。乳腺癌超聲圖像顯示：形態(tài)不規(guī)則，邊界不清晰，后方回聲衰減，2～3級(jí)血流。見圖1(插頁(yè)六)。

2.2 Ki-67蛋白和CerbB-2蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá) 107例乳腺癌組織中Ki-67蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為81.21%(87/107)，CerB-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為73.83%(79/107)。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示：Ki-67與CerbB-2表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.264，P=0.001)。見圖 2(插頁(yè)六)。

2.3 Ki-67蛋白和CerbB-2蛋白的表達(dá)與超聲圖像特征的關(guān)系 腫瘤縱橫比>1、內(nèi)部回聲不均勻、后方回聲衰減、腫塊內(nèi)微小鈣化、血流分級(jí) 2～3級(jí)與乳腺癌組織中Ki-67蛋白表達(dá)有關(guān)(P<0.05)，而邊界、直徑、形狀與Ki-67蛋白表達(dá)無關(guān)(P>0.05)；乳腺癌邊界、直徑、形狀、腫瘤縱橫比>1、內(nèi)部回聲不均勻、后方回聲衰減、腫塊內(nèi)微小鈣化、血流分級(jí) 2～3 級(jí)與乳腺癌組織中CerbB-2蛋白表達(dá)有關(guān)(P<0.05)。見表1和2。

2.4 影響乳腺癌患者預(yù)后多因素Cox模型回歸分析 多因素Cox模型回歸分析結(jié)果顯示：影響乳腺癌患者5年生存結(jié)局的獨(dú)立因素包括CerbB-2蛋白()表達(dá)(P=0.002)、Ki-67蛋白()表達(dá)(P=0.006)、血流分級(jí) 2～3 級(jí)(P=0.036)、后方回聲衰減(P=0.001)和腫瘤縱橫比>1(P=0.002)。見表3。

3 討 論

彩色多普勒超聲是乳腺癌診斷的重要輔助檢查之一，近年來，其在乳腺癌患者術(shù)前診斷中應(yīng)用越來越廣泛，可提高乳腺癌臨床檢出率。研究[6-7]顯示：常規(guī)彩色多普勒血流成像(color doppler flow ima-ging, CDFI)易受檢測(cè)部位、腫瘤組織深淺和血流速度等影響，對(duì)相對(duì)細(xì)小血管分支及低速血流信號(hào)難以檢測(cè)。乳腺癌的超聲表現(xiàn)為低回聲，邊緣毛刺、角狀邊緣、前后徑大于橫徑、腫塊后方回聲衰減、點(diǎn)狀鈣化和高回聲暈[8]。本研究中，107例乳腺癌患者中，病灶直徑>2 cm者占62.6%，形態(tài)不規(guī)則者占50.5%，邊界不清晰者占51.4%，腫瘤縱橫比>1者占40.2%，內(nèi)部回聲不均勻者占62.6%，腫瘤的后方回聲衰減占29.9%，腫塊中發(fā)現(xiàn)細(xì)小鈣化者占30.8%，血流分級(jí) 2～3 級(jí)者占48.6%，該結(jié)果與其他研究結(jié)果基本一致[9-10]。

研究[21]表明：Ki-67與細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄密切關(guān)系，在細(xì)胞分裂增殖期活躍。關(guān)于腫瘤的形態(tài)與生

表1 乳腺癌組織中Ki-67表達(dá)與超聲圖像特征的關(guān)系

續(xù)表1

Ultrasound featuren Ki-67 expression+-χ2PInternal calcification Yes No337422(66.67)23(31.08)11(33.33)51(68.92)13.022<0.01Blood flow grade 0 1 2 3282725273(29.63)8(29.63)15(0.60)19(70.37)25(70.37)19(70.37)10(9.40)8(29.63)9.2540.007

表2 乳腺癌組織中CerbB-2表達(dá)與超聲圖像特征的關(guān)系

表3 多因素回歸COX模型分析乳腺癌患者預(yù)后獨(dú)立影響因素

χ2=47.20，ν=5，P<0.001.

物學(xué)標(biāo)記物之間的關(guān)系，各研究報(bào)道結(jié)果相異，腫瘤形態(tài)不規(guī)則及其腫瘤縱橫比>1 提示腫瘤細(xì)胞向腫瘤周圍轉(zhuǎn)移速度不一樣[22-23]。本研究中，腫瘤的縱橫比與Ki-67蛋白及 CerbB-2蛋白有關(guān)聯(lián)，其主要原因可能是其均在細(xì)胞增殖和分化過程中發(fā)揮作用。乳腺癌邊緣毛刺征及周邊高回聲暈是其特征性指標(biāo)，本研究結(jié)果顯示：邊緣有毛刺征者Ki-67蛋白和CerbB-2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均高于無此征象者，說明 Ki-67蛋白和CerbB-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)者腫瘤細(xì)胞分化差，惡性度高，具有更高的侵襲性行為。乳腺癌的鈣化是組織細(xì)胞變性、壞死和鈣鹽沉著造成的。本研究中，微小鈣化者Ki-67蛋白和CerbB-2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均高于無此征象者，提示存在微鈣化的腫瘤的侵襲性強(qiáng)，預(yù)后不良。

本研究存在一定的缺陷，如未進(jìn)行隨訪，未進(jìn)行生存分析；本研究中樣本量不足，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義可能不充分。

綜上所述， 乳腺癌的超聲聲像圖表現(xiàn)與Ki-67蛋白和CerbB-2蛋白表達(dá)等有密切關(guān)聯(lián)，通過對(duì)乳腺癌聲像圖特征的分析，可為乳腺癌的生物學(xué)行為及臨床預(yù)處理和判斷患者預(yù)后等提供依據(jù)。